[发明专利]一种定量检测蛋白乙酰化水平的方法

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，具体的说，涉及一种定量检测乙酰化蛋白的方法。

背景技术

蛋白乙酰化修饰是一种重要的翻译后修饰，其参与多种细胞生物过程的调控，比如基因转录（Bioessays,1998,20(8):615-626）、细胞调亡（Molecular cell,2004.13(5):627-638）、细胞分化（The Journal of Immunology,2008,181(7): 4545）、DNA修复（Journal of Biological Chemistry,2010,285(7):4398），同时乙酰化修饰与肿瘤的发生、发展也有密切关系(Science's STKE,2000,19(6):1176)。

但在研究乙酰化翻译后修饰中，存在蛋白质乙酰化修饰较难产生亲和力强的抗体，且利用抗原-抗体相互作用免疫沉淀反应富集细胞中的乙酰化蛋白质非常困难等问题；从化学的角度讲，乙酰基相对稳定，尚未找到合适的，类似于磷酸化（Molecular & Cellular Proteomics,2007,6(9):1656-1665）和糖基化修饰（Journal of Proteome Research,2009, 8(2):662-672）基于化学键结合的富集材料。因此目前还缺乏快速、非放射定量检测蛋白乙酰化水平的实用方法。

基于以上特点，蛋白芯片具有样品处理简单，样品用量少，高通量，特异性和灵敏度高，可以定量检测的优点，目前广泛应用于检测细胞因子，凝集素等。

专利中描述了制备蛋白芯片以及利用蛋白芯片检测蛋白乙酰化水平方法，该法克服了用乙酰化抗体直接免疫沉淀富集时抗体亲和力弱而难以高效富集的弊端，为建立高通量蛋白质乙酰化修饰差异谱分析提供技术平台，有利于探讨乙酰化水平状态对肝癌转移的预测价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速简便的定量检测乙酰化蛋白的方法。

本发明利用抗原抗体相互作用原理，制备蛋白芯片，应用蛋白芯片定量检测蛋白乙酰化水平。

本发明提供的一种定量检测蛋白乙酰化水平的方法，具体步骤如下：

（1）制备蛋白芯片

利用芯片点样仪器，在三维凝胶芯片上点1-3nL蛋白抗体PBS溶液，点好后储存于4℃冰箱待用，其中所述蛋白抗体PBS溶液的质量-体积浓度为100-300μg/ml；

（2）绘制标准曲线

将上述制备好的蛋白芯片，用山羊血清PBS-T溶液封闭1-2小时, 洗涤，甩干；之后用磷酸缓冲液稀释得到的10倍稀释的肝癌病人血清作为稀释液稀释乙酰化蛋白抗原得到的不同浓度的标准乙酰化蛋白抗原溶液孵育1-2小时，洗涤，甩干；接着用生物素标记的检测抗体PBS溶液孵育1-2小时，洗涤，甩干；再用荧光标记的链霉素PBS溶液孵育0.5-1小时，洗涤，甩干；最后利用激光共聚焦芯片扫描仪扫描上述处理完毕的芯片，检测点样点的荧光强度，绘制标准曲线，得出标准乙酰化蛋白抗原溶液浓度和信号之间的线性关系；其中，所述山羊血清PBS-T溶液的体积百分比浓度为0.1%-10%，所述标准乙酰化蛋白抗原溶液的质量-体积浓度分别为0.25μg/ml、0.5μg/ml、0.75μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、6μg/ml、8μg/ml，所述生物素标记的检测抗体为生物素标记的乙酰化抗体，所述生物素标记的检测抗体PBS溶液质量-体积浓度为0.5-2.5μm/ml，所述荧光标记的链霉素PBS溶液质量-体积浓度范围为5-20μm/ml； 

（3）实际样品检测

将步骤（1）中制备的蛋白芯片用山羊血清PBS-T溶液封闭后，用待测样品孵育，洗涤，甩干；接着用生物素标记的检测抗体孵育，洗涤，甩干；再用荧光标记的链霉素孵育，洗涤甩干，其中所述生物素标记的检测抗体为生物素标记的乙酰化抗体，反应具体条件同步骤（2）；芯片处理完毕后，利用激光共聚焦芯片扫描仪扫描，检测点样点的荧光强度，再根据标准曲线定量待测样品的蛋白乙酰化水平。

本发明中，步骤（1）中所述蛋白抗体为牛血清白蛋白抗体或者马肌红蛋白抗体；步骤（2）中所述标准乙酰化蛋白抗原为乙酰化牛血清白蛋白或者乙酰化马肌红蛋白。

本发明中，步骤(1)中蛋白抗体PBS溶液的质量-体积浓度为200μg/ml。

本发明中，步骤（2）中所述山羊血清PBS-T溶液的体积百分比浓度为5%，所述生物素标记的检测抗体PBS溶液的质量-体积浓度为2μg/ml；所述荧光标记的链霉素PBS溶液质量-体积浓度为10μm/ml。