[发明专利]一种高活性负载抗原的树突状细胞的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种高活性负载抗原的树突状细胞的制备方法，属于生物技术领域。

背景技术

肿瘤生物治疗是继手术、放疗、化疗之后的第四种治疗模式。肿瘤细胞免疫治疗是肿瘤生物治疗中疗效最为切实的方法之一，由于肿瘤细胞的多态性决定了根治肿瘤不可能仅仅依靠一种方法。抗原递呈细胞(antigen-presenting cell，APC) 是能摄取、加工处理抗原，并将抗原递呈给淋巴细胞的一类免疫细胞，作为特异性肿瘤杀伤细胞产生和制备过程中不可缺少的组成部分，在肿瘤的免疫治疗中发挥着不可替代的作用。树突状细胞（dendritic cell；DC）是存在于外周血、皮肤、淋巴器官及胸腺中的抗原递呈细胞之一，富集于淋巴组织及非淋巴组织中，具有强大的抗原递呈能力，可将抗原肽表达到树突细胞的Ⅰ类和Ⅱ类上，并分别激活CD4、CD8T细胞，能够诱导特异性的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)生成，非常适用于多种肿瘤的免疫疗法。

DC用于肿瘤免疫治疗的疗效与DC数量和DC负载肿瘤抗原的量密切相关。目前常规DC制备方法是先分离出外周血中的单个核细胞，加入DC无血清培养液，适量的白介素-4，GM-CSF等细胞因子将单核细胞培养成DC细胞，再加入相应的肿瘤抗原继续培养2天，使DC成为负载肿瘤抗原的DC，这种细胞与淋巴细胞共同培育，产生具有肿瘤特异性杀伤活性的细胞毒性T淋巴细胞（CTL），CTL细胞的杀伤活性与DC的数量和DC负载肿瘤抗原的量有密切的关系。虽然这种方法通过添加细胞因子，使DC的数量明显增加，但由于肿瘤抗原的抗原性较弱，DC对其的抗原递呈能力也就较低，使其产生的CTL细胞的杀伤活性不足，进而影响对肿瘤的治疗效果。如中国专利文献CN101755045A公开了一种树突状细胞的制备方法，在多种细胞因子（GM-GSF、SCF）存在下培养树突状细胞前体细胞，制备足够数量的DC细胞用于免疫治疗，但由于肿瘤抗原的抗原性较弱，DC对其的抗原递呈能力也就较低，进而影响对肿瘤的治疗效果。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是现有技术中制备的树突状细胞由于肿瘤抗原的抗原性较弱，DC对其的抗原递呈能力也就较低，使其产生的CTL细胞的杀伤活性不足，进而影响对肿瘤的治疗效果的技术问题，进而提供一种高活性负载抗原的树突状细胞的制备方法，既可以保证树突状细胞的数量，又可以提高树突状细胞负载肿瘤抗原的量。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种高活性负载抗原的树突状细胞的制备方法，包括以下步骤：

a、从外周血中采集和分离单个核细胞；

 b、将步骤a得到的单个核细胞加入DC无血清培养液中，再向培养液中加入细胞因子IL-4和GM-CSF，然后置于培养箱中培养后收集树突状细胞；

 c、在含有步骤b收集树突状细胞的培养液里，加入相应的抗原和结核分枝杆菌纯蛋白衍生物，继续培养，即可获得高活性的负载抗原的树突状细胞。

所述步骤c培养液中结核分枝杆菌纯蛋白衍生物（PPD）的浓度为0.1u/ml-2u/ml。

所述步骤c培养液中结核分枝杆菌纯蛋白衍生物（PPD）的浓度为0.5u/ml，继续培养的时间为2天。

所述步骤b中将培养液置于 37℃、5%CO2培养箱中培养6天收集树突状细胞。

所述步骤a中所述分离单个核细胞是将获得的血细胞样本，用淋巴细胞分层液除去混杂的红细胞和粒细胞，用生理盐水低速离心洗涤3次，除去血小板获得。

所述步骤b中IL-4浓度为5ng/ml-100ng/ml，GM-CSF浓度为10ng/ml-500ng/ml，培养3-4天补液至原体积。

所述步骤b中IL-4浓度为50ng/ml，GM-CSF浓度为250ng/ml。

所述步骤b的培养液中加入抗生素。

本发明还涉及一种所述方法制备的高活性负载抗原的树突状细胞。

本发明所述的技术方案相对于现有技术具有以下优点：