[发明专利]一种重组猪干扰素β1及其编码基因和表达方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程基因领域，涉及一种重组猪干扰素β1及其编码基因，以及其表达、 纯化和包涵体复性方法。

背景技术

干扰素(Interferon，IFN)是一组具有多种功能的活性蛋白质（主要是糖蛋白），是一种由 单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子。它们在同种细胞上具有广谱的抗病毒、影响细胞生长， 以及分化、调节免疫功能等多种生物活性。根据IFN的来源即动物种类、细胞类型、诱生剂 的性质和诱生条件不同，可分为α、β、γ三种。其中，干扰素β主要由成纤维细胞产生，在 体内具有增强细胞表面HLAI、Ⅱ类抗原表达，提高血清新蝶吟和β₂-微球蛋白水平、增强NK 细胞活力和ADCC作用以及外周淋巴细胞2’，5’-寡腺昔合成酶活性。临床已将干扰素β应用 于多发性硬化症、乙型肝炎、丙型肝炎等的治疗中。

我国是生猪生产猪大国，猪圆环病毒病、猪繁殖与呼吸综合征、猪伪狂犬病等多种猪病 毒性传染病给养猪业带来了巨大的经济损失。目前我国虽广泛接种各种猪病疫苗，仍不能有 效控制疾病流行。干扰素β具有较强的抗病毒效应及免疫调节活性，与IFN-α一样,它具有 广谱抗病毒作用,可作为干扰素α的替代制剂，并且干扰素β对病毒的抑制程度会因病毒的种 类不同而有很大差异，例如干扰素β比干扰素α具有更好的抗SARS-CoV效果；干扰素β在 酸、碱、热的耐受性也明显优于干扰素γ。同时，IFN-β还可抑制成纤维细胞、上皮细胞、内 皮细胞以及造血细胞的增殖，抑制和杀伤肿瘤细胞，以及对免疫系统起调节作用，因此在兽 药领域中的应用越来越广泛。然而，干扰素β存在明显的种属差异，仅依靠在活猪体内提取 远远不能满足市场的要求。动物用基因工程干扰素β无药物残留、无副作用，很受临床兽医 和养殖户的青睐，但是市场上多数类似药物依然面临着产量不足、质量层次不齐、价格昂贵 等问题。因此，本专利首先提供了一种成本低廉、质量稳定的可大量表达重组猪干扰素β1的 表达系统和表达方法。

原核表达系统是最早被采用进行研究的，这也是目前掌握最为成熟的表达系统。该项技 术的主要方法是将已克隆入目的基因DNA片段的载体(一般为质粒)转化细菌(通常选用的是 大肠杆菌)，通过IPTG诱导并最终纯化获得所需的目的蛋白。其优点在于能够在较短时间内 获得基因表达产物，而且所需的成本相对比较低廉。本专利即采用了大肠杆菌表达体系对重 组猪干扰素β1进行的异源表达，从而获得了大量的目的蛋白。但是，由于原核表达系统的缺 乏翻译后修饰的体系，其表达的真核生物蛋白常以低活性的包涵体形式产生。而包涵体的复 性是一个非常复杂的过程，不仅与复性条件和复性材料息息相关，更在很大程度上取决于蛋 白质自身的性质。如果复性条件不适宜，将导致分子内二硫键的错配、分子间以共价结合或 疏水结合的方式形成聚合体，从而使产物沉淀析出，影响得率，并且降低重组蛋白的比活率， 影响产品质量。因此，本专利所要解决的另一个技术问题是，采用适当的条件对大肠杆菌表 达体系生产的重组猪干扰素β1的包涵体进行复性，得到具有较高比活力的产物。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足之处，通过密码子优化的方式，提供一种可在大肠 杆菌内高效表达重组猪干扰素β1以及其基因和表达、纯化、复性方法。

本发明提供了一种重组猪干扰素β1，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明提供了编码上述所述重组猪干扰素β1的基因，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。 该序列是专为大肠杆菌表达系统进行密码子优化得到的序列，相比之下能显著提高异源基因 在宿主菌中的表达效率。

本发明还提供了包含了上述所述编码重组猪干扰素β1的基因的载体，所述的载体优选为 原核表达质粒，最优选为pET21b。

本发明还提供了包含有上述所述载体的大肠杆菌菌株，优选地，所述菌株选自大肠杆菌 BL21（DE3）菌株。

本发明还提供了重组猪干扰素β1在大肠杆菌表达方法，包括如下步骤：

该方法的步骤为：

1.挑取一个含有上述所述重组猪干扰素β1的大肠杆菌菌落，接入LB培养液，培养过夜；

2.取过夜培养物接入于LB培养液中，震荡培养至对数中期（A₆₀₀=1.0）；