[发明专利]一种分析酒醅微生物群落结构的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种分析酒醅微生物群落结构的方法，属于微生物生态技术领域。

背景技术

基于聚合酶链式反应的变性梯度凝胶电泳技术（denaturing gradient gel electrophoresis）近年来广泛用于不同环境中微生物遗传多样性分析的一种分子指纹分析技术。1993年，Muyer等首次将该技术应用于微生物生态的研究，随后便大量用于自然界微生物群落的遗传多样性和种群差异方面研究。根据DNA的解链特性，不同碱基组成的DNA双螺旋发生变性所要求的变性剂浓度不同，混合双链DNA在变性剂浓度呈线性梯度增加的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，当泳动到与DNA变性所需变性剂浓度一致的凝胶位置时，相对应的DNA发生解链变性，导致电泳迁移速率降低。由于泳动受阻的DNA分子在梯度凝胶中的停留位置不同，从而使不同DNA分子得以分离。影响变性梯度凝胶电泳的因素主要有电泳电压、电泳时间、变性胶浓度、变性胶质量等。在多菌种存在的复杂环境中，由于大量相似菌群的存在，变性梯度胶中差异很小的基因片段很难将其完全分离，且变性胶的制作差异也严重影响分离效果，在样品因数和人为操作等因素的影响下，造成大量微生物信息的丢失。寻求一种能很好将复杂环境中菌株分离的方法，才能更加全面准确地揭示环境中微生物群落结构信息。在现有方法中，将DGGE胶上的一条带所代表的DNA片段切下、回收后以该回收单一条带DNA作模板进行PCR扩增后，再次进行DGGE分析，通过对第二次DGGE中可能存在的多条带再次回收条带基因，该方法可以一定程度上分离出多条带信息，高度相似的条带即使经多次DGGE分析，仍无法将条带分开。此外DGGE成本高、操作繁琐，大量相似条带能否完全分开，仍受质疑。寻求一种能很好将复杂环境中菌株分离的方法，才能更加全面准确地揭示环境中微生物群落结构信息。

中国白酒生产具有开放式的多菌种共存的固态发酵工艺的特点，多菌系的共同作用形成了白酒独特的风格特征。对白酒微生物的研究历史久远，但由于技术方法的限制，对酒醅微生物群落多样性的认识仅依赖于传统的形态特征、生理生化特性的分类和鉴定，且传统方法研究的是体系中主要的可培养微生物，不适应对难于培养和不能培养微生物菌群分析的需要。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种酒醅中微生物群落结构的方法。

本发明的技术方案是一种分析酒醅微生物群落结构的方法，包括基因组DNA的提取、16S rDNA的PCR扩增、DGGE电泳（变性梯度凝胶电泳）、回收电泳后的16S rDNA单一条带、分析回收条带；所述分析回收条带包括如下步骤：用电泳后回收的16S rDNA构建克隆库、酶切分型、测序及GenBank比对分析，即得到酒醅中微生物的群落结构信息。

其中，所述的基因组DNA的提取包括酒醅样品的PBS（磷酸缓冲液）预处理和基因组DNA提取；所述的PBS预处理包括如下步骤：向酒醅中加入pH7.4的PBS缓冲液和玻璃珠，涡旋，200~500g（优选200g）离心5~10min，吸取上清液，10000~12000rpm（优选12000rpm）离心5~10min，收集菌体沉淀；酒醅与PBS缓冲液之间的质量比为1~5︰1~10（优选1︰3）；酒醅与玻璃珠之间的质量比为1~2︰1~5（优选1︰3）；玻璃珠的直径为2~8mm。

优选的，离心时间为5min。

其中，所述的DGGE电泳的变性胶浓度为10~50%，电压为150~220V，电泳时间120~300min。

其中，所述的DGGE电泳的电压为200V，电泳时间210min。

其中，所述的回收电泳后的16S rDNA单一条带包括如下步骤：完成DGGE电泳后，切割变性胶中单一条带放于灭菌离心管，加入30~60μL超纯水，于4~10℃放置10~24小时后1000~3000rpm离心5~10min，取上清液。该上清液可作为PCR模板扩增回收条带中16S rDNA基因片段。

其中，所述的构建克隆库包括如下步骤：以电泳后回收的16S rDNA单一条带上清液为模板，扩增16S rDNA，扩增片段后与T载体连接，导入大肠杆菌，挑选阳性克隆构建克隆库。

前述步骤中所用的扩增引物为细菌16S rDNAV3区的通用引P₂和P₃-GC。