[发明专利]一种甘蓝型油菜中的水孔蛋白基因及测序方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因技术领域，尤其涉及一种甘蓝型油菜中的水孔蛋白基因及测序方法。

背景技术

水孔蛋白(aquaporin，AQP)是指细胞膜上能选择性地高效转运水分子的膜内在蛋白，属于MIP (major intrinsic protein)超家族。发明水孔蛋白之前，水分子被认为是只能以自由扩散的方式进出细胞的膜结构。但水孔蛋白的发明颠覆了这一观点，证明了水分子也可以被膜蛋白以主动运输的方式运送进出膜结构。自1993年从拟南芥中分离得到第一个植物水孔蛋白γ-TIP至今，已在真细菌、古生菌、真菌、动物和植物等多种生物中发明水孔蛋白。通常植物水孔蛋白按定位和属性不同而分为5 类：①质膜内在蛋白(plasma membrane intrinsic proteins， PIPs) 位于质膜上；②液泡膜内在蛋白(tonoplast intrinsic proteins， TIPs) 处于液泡膜上；③类Nod26 膜内在蛋白(nodulin 26-like intrinsic proteins，NIPs)存在于根瘤菌和豆科植物的共生膜上；④小分子碱性膜内在蛋白(small and basic intrinsic proteins，SIPs)；⑤以及类GlpF膜内在蛋白(GlpF-like intrinsic proteins，GIPs)。

PIP是其中很重要的一类，通常定位在细胞质膜。水孔蛋白PIP调节水分子进出细胞膜，进而进一步改善植物对干旱或者高盐胁迫的耐受性。甘蓝型油菜是我国最重要的油料作物之一，我国的油菜种植面积和总产量位于世界首位。干旱胁迫往往严重影响油菜的产量。所以研究甘蓝型油菜PIP基因就具有重要的理论和实践意义。

现在常用的克隆一个新的基因序列的方法有：利用亲缘关系近的物种的同源序列设计引物直接PCR，末端快速克隆法（Rapid amplification of cDNA ends，RACE），化学合成，电子克隆等。关于水控蛋白PIP3基因，在不同的物种中陆续做了不同程度的方向的研究。但是对于甘蓝型油菜，中国乃至世界最重要的油料作物之一，其PIP3或类似基因的研究不多见。目前仅在NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/U78297.1）上有拟南芥PIP3（GenBank: U78297.1）的编码区核酸序列和相应蛋白质的氨基酸序列。

高等植物水孔蛋白分为5个大类，每个大类下还有若干小类。根据NCBI数据库已知的4个甘蓝型油菜水孔蛋白（GenBank: AF118383.1，AF118381.1， EU487188.1和EU487187.1）分析发明，这4个已知的水孔蛋白与BnPIP3-like的核酸序列相似性分别在44.85%-69.94%不等，并且它们分别属于PIP2或者TIP等类别。油菜内源还有很多类别的水孔蛋白未知，比如与拟南芥PIP3同源的基因就尚未知晓。这就对全面了解水孔蛋白功能以及进化关系的探索和分析留下了障碍和空白。

发明内容

本发明实施例提供一种甘蓝型油菜中的水孔蛋白基因及测序方法，旨在解决现有技术只知道拟南芥PIP3（GenBank: U78297.1）的基因编码区核酸序列以及相对应的蛋白质的氨基酸序列，其功能正在逐步被验证。但是甘蓝型油菜体内与拟南芥PIP3（GenBank: U78297.1）相应的同源基因未知的问题。

本发明的一个方面，提出了一种甘蓝型油菜中的水孔蛋白基因，包括：（a）序列表中的核酸序列；和（b）序列表中的氨基酸序列。 

本发明的另一个方面，提出了一种甘蓝型油菜中的水孔蛋白基因的测序方法，包括以下步骤：A、获得甘蓝型油菜的无菌苗；B、提取所述无菌苗中的总RNA和总cDNA；C、通过聚合酶链反应扩增得到的基因全长；D、对所述扩增得到的聚合酶链反应产物处理得到大小正确条带的菌液；E、对所述菌液进行测序，对得到的测序结果进行软件分析。

优选的，所述步骤A进一步包括：将甘蓝型油菜种子经75%乙醇浸泡1分钟，0.1%升汞浸泡8min消毒处理后，用灭菌水洗3-5次，置于MS固体培养基上；在人工气候箱内25°C、相对湿度70%以及16小时光照、8小时黑暗的条件下生长。