[发明专利]一种昆虫翅盘异常发育基因片段及其dsRNA和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物领域，具体涉及一种昆虫翅盘异常发育基因片段及其dsRNA和dsRNA致死害虫的应用。

背景技术

害虫危害极大地制约了我国农作物产量和质量的提高，目前控制害虫的主要手段是施用化学杀虫剂，但是大量施用化学杀虫剂会导致一系列问题，诸如：1）害虫抗药性增强，防治成本提高；2）农药残留引起一系列环境污染和食品安全问题；3）破坏生态平衡，对非靶标生物有较大的影响。现有的生物防治方法如生物杀虫剂等作用时间长且起效慢，而敲除害虫生长发育的特异性基因的方法是将来害虫综合治理的发展趋势之一。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指外源或内源的双链RNA（double2stranded RNA，dsRNA）特异性地引起基因表达沉默的现象。它具有稳定转座子、清除异常RNA、调节基因表达等功能，且RNAi沉默基因的高效率、高特异性以及能在细胞内进行人工诱导，使RNAi作为一种反向遗传技术广泛应用于基因功能的研究。

RNAi一直广泛应用于基因功能的研究，在利用该技术成功鉴定了多种昆虫基因功能的同时，科学家们试图将该技术应用于害虫防治领域，目前已在鳞翅目和鞘翅目昆虫中试验成功。通过对棉铃虫幼虫饲喂表达P450基因（CYP6AE14)）和谷胱甘肽基因GST1dsRNA的棉花，诱导RNAi并阻碍了幼虫发育，这一技术为田间害虫控制开辟了新领域（Mao et al.，2007)；采用RNA干扰技术，开展翅盘异常发育基因dsRNA在害虫防治中的应用具有重要的意义。

相比于传统的害虫控制策略，害虫基因沉默控制的优势在于：(1)根据害虫基因序列的特异性，可以设计使目的基因沉默的专一性基因，同时由于RNA分子的不稳定性，不会出现残留污染问题，因此对环境生态安全和食品安全没有任何影响；(2)防治对象的特异性极高，不会对其他昆虫特别是害虫天敌产生负面影响，有利于害虫生物防治和综合治理体系的实施；(3)对由于基因突变产生的抗性问题，很容易通过改变小RNA的序列来解决，以变制变，因此不会产生严重的抗性问题。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种昆虫翅盘异常发育基因片段。

本发明的另一目的在于提供上述的昆虫翅盘异常发育基因片段的dsRNA。

本发明的再一目的在于提供上述的昆虫翅盘异常发育基因片段的dsRNA的用途。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种昆虫翅盘异常发育基因片段，其核苷酸序列是SEQ ID NO：1。

上述的昆虫翅盘异常发育基因片段（SEQ ID NO：1），是根据NCBI数据库设计上游引物（序列如SEQ ID NO：2所示）和下游引物（序列如SEQ ID NO：3所示），通过PCR扩增获得SEQ ID NO：1。

一种昆虫翅盘异常发育基因片段的dsRNA，是以上述的昆虫翅盘异常发育基因片段（SEQ ID NO：1）为模板，通过试剂盒合成。

上述的昆虫翅盘异常发育基因片段的dsRNA可以用于致死害虫，即将dsRNA注射到昆虫体腔。实验结果表明：上述的昆虫翅盘异常发育基因片段的dsRNA可以特异性地沉默昆虫体内翅盘异常发育基因的mRNA表达，使昆虫在蜕皮化蛹和羽化过程中死亡。

在RNAi过程中，只有导入到生物体内的dsRNA被Dicer酶切割成siRNA后才能发挥作用。一般而言，具有功能性的siRNA分子其最小剪辑长度为19bp。即设计的能够沉默目标基因的dsRNA与这个物种之中的其他基因相比，没有连续19bp以上的碱基完全相同，那么就能保证降低特异性目的片段的转录水平。但是，如果设计的dsRNA是针对同一物种的很多基因共有保守序列，特别是对具有大于19bp以上完全相同的连续碱基的两个或多个目标基因，那么则有可能会导致目标基因的“脱靶效应”。根据上述理论，我们就可以利用“脱靶效应”沉默一个基因家族的多个基因或不同物种的同类基因。

本发明根据上述dsRNA设计的基本原则，在斜纹夜蛾AWD mRNA序列(即JF690666)上选取了537bp的片段作为dsRNA的表达区域，通过序列分析和单一性检测没有发现连续19bp以上碱基序列完全相同的基因，因此确定该序列可以作为靶标基因序列。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：