[发明专利]一种水稻OsICE1基因双元载体及其应用方法

权利要求书

1.一种水稻OsICE1基因的双元载体，该双元载体包括Pubi:ICE1:NOS，Pubi:ICE1-FLAG:NOS，Pubi:ICE1-HA:NOS, Pubi:ICE1-MYC:NOS与ICE1-antisense载体。

2.一种水稻OsICE1基因双元载体的应用方法，其特征在于，该应用方法把构建的OsICE1基因的五种表达载体：Pubi:ICE1:NOS，Pubi:ICE1-FLAG:NOS，Pubi:ICE1-HA:NOS，Pubi:ICE1-MYC:NOS和ICE1-antisense转入水稻受体材料日本晴中，经繁殖传代，获得T1代转基因植株。

3.如权利要求2所述水稻OsICE1基因双元载体的应用方法，其特征在于，该应用方法还包括以下步骤:总RNA的提取方法：  

水稻材料日本晴的种子经25%的次氯酸钠消毒，转入发芽盒中萌发，胚芽长至2cm时挑选植株大小一致的水稻植株，移入人工气候箱中的培养箱内生长，营养液为Hogland培养液；每两天换一次培养液，到四叶一心期时，称取0.2克叶片，在研钵中倒入液氮速冻、研碎，研磨充分后转入1.5毫升的离心管中，迅速加入1毫升Trizol试剂，40℃下12000g离心10min；取上清，加入0.2毫升的氯仿，荡后放置2-3min；40℃下12000g离心15min，吸上层水相至新1.5ml离心管中；加0.5ml氯仿，剧烈振荡后放置2-3min；40℃下12000g离心15min，把上层水相转入1.5ml离心管中，加入0.5ml的异丙醇,振荡后放置10min，40℃下12000g离心后弃去上清，沉淀即为RNA；加入1ml 70%乙醇洗涤沉淀，40℃下12000g离心5min,去上清；沉淀干燥后RNA溶于1‰DEPC水中；取1μlRNA溶液，用分光光度计测定总RNA的浓度和纯度。

4.如权利要求2所述水稻OsICE1基因双元载体的应用方法，其特征在于，该应用方法还包括以下步骤:

cDNA合成方法：

取上述提取的RNA样品5μg,加入50μmolL^-1 Oligo dT 1μl,再加1‰ DEPC水补足10μl；70℃水浴中5min后，再依次加入Rnase inhibitor 0.5μl和5×RT buffer 5μl,10mM dNTP 2.5μl，M-MLV反转录酶1μl，1‰DEPC水补足至25μl;42℃水浴1 h后，再75℃水浴15min终止反应,-80℃保存。

5.如权利要求2所述水稻OsICE1基因双元载体的应用方法，其特征在于，该应用方法还包括以下步骤:

OsICE1基因cDNA全长的获得方法：

用AtICE1基因（AT3G26744.1）序列在NCBI核酸数据库中搜索水稻同源基因，获得与AtICE1相似性为57%的水稻基因序列（编号为Os11g052370），依据该同源基因Os11g052370的序列设计引物，用上述获得的水稻材料日本晴总cDNA为模板，设计PCR引物，引物序列为：

OsICE1-F: 5’ – CATCTCTGCCATCTCCTTC– 3’

OsICE1-R: 5’ –GATAAACTGGTTCAGCAAGC– 3’

该PCR引物所扩增的区段包含完整的OsICE1阅读框；PCR反应程序如下：94℃预变性4min,98℃变性10s，60℃复性延伸2min，35个循环后，72℃ 10min；扩增后的产物经琼脂糖凝胶电泳分离，将目的条带切割，用凝胶回收试剂盒进行产物回收;PCR产物回收后用pUCm-T载体连接;取5μl连接产物加入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，冰浴lO-20min，42℃热激90秒，冰浴10分钟，加入500μl LB液体培养基，37℃摇床上低速摇菌l小时；取100μl菌液均匀涂于含有100μgmL^-1安苄的LB固体培养基上生长l2h-l4h后，挑取阳性菌落进行DNA测序，OsICE1基因的cDNA序列与NCBI NM_001074519序列完全相同；获得含有目的基因OsICE1 cDNA全长序列的重组质粒，命名为pICE1。