[发明专利]一株高产丙酮酸的大肠杆菌菌株的构建及应用

说明书

技术领域

本发明涉及丙酮酸的生产方法，特别涉及一种构建用于发酵生产丙酮酸的大肠杆菌菌株的方法和生产丙酮酸的方法，属于微生物工程技术领域。

背景技术

丙酮酸是一种重要的有机中间体，在化工、制药和农用化学品等工业及科学研究中有着广泛的用途。丙酮酸是机体代谢的中间产物，处于糖酵解途径的末端，同时又连接着EMP途径和TCA循环，处于代谢途径中的关键代谢节点，在细胞中很容易代谢为其他产物，难以积累，只有切断或弱化丙酮酸的进一步代谢，才能达到使其在细胞中积累并分泌到胞外的目的。

目前用于丙酮酸生产菌株有酵母、放线菌和细菌等。工业生产所用菌株主要是酵母，其中以球拟酵母的研究和应用最多，如专利公开号CN101157941A中披露通过控制葡萄糖浓度和维生素浓度来提高多重营养缺陷型光滑球拟酵母(Torulopsis glabuata)CCTCC M202019发酵生产丙酮酸的能力，在30℃发酵92h后，丙酮酸产量为91.2g/L，糖酸转化率为0.75g/g。根据专利公开号CN1740330A所述，利用皮状丝孢酵母9070(CGMCC0754)进行摇瓶发酵丙酮酸，在28℃发酵3天后产量最高达到43g/L。如专利公开号CN101096691A所述，利用多重维生素营养缺陷型菌株光滑球拟酵母(Torulopsis glabuata)发酵生产丙酮酸，通过在发酵过程中向培养基中添加2,4-二硝基苯酚(DNP)来降低菌体内能荷水平来提高丙酮酸产量，在5L发酵罐中，发酵60h丙酮酸最高达到58.9g/L。

丙酮酸脱氢酶PDH为多酶复合体，包含了三种酶：丙酮酸脱氢酶（E1p）、二氢硫辛酰转乙酰基酶（E2p）和二氢硫辛酸脱氢酶（E3），催化丙酮酸脱羧，并伴随乙酰CoA的生成，这是中心代谢途径的第一步反应。其中，aceE、aceF和lpdA分别编码这三种蛋白。当敲除aceE后，PDH失去将丙酮酸转化为乙酰CoA的能力，中心代谢途径因为没有足量的乙酰CoA供应而出现障碍，但是在培养基中添加一定量的乙酸盐，菌体可以利用乙酸盐合成乙酰CoA，从而可以弥补生长上的不足。在缺失aceE的大肠杆菌中，菌体可以利用乙酸盐而保持生长，并开始积累丙酮酸。

利用酵母产丙酮酸的发酵温度一般在30℃左右，而大肠杆菌最适发酵温度为37℃，具有发酵温度高、繁殖速度快等优点，且生产所用的酵母都为维生素等多种营养缺陷型，培养基配制比较复杂，而本发明所用的大肠杆菌遗传标记简单，只有aceE基因缺陷型，在培养基中添加一定量的乙酸盐即可发酵，发酵条件粗放，可以作为丙酮酸的生产菌株。

发明内容

本发明所要解决的一个技术问题在于敲除大肠杆菌丙酮酸脱氢酶aceE基因，以阻断丙酮酸进入TCA循环，从而构建一株用于高产丙酮酸的大肠杆菌。

其特征在于是通过同源基因双交换阻断技术，敲除大肠杆菌MG1655中的丙酮酸脱氢酶aceE基因，以获得丙酮酸高产菌株。

其特征在于包括如下步骤：

(1)将pKD46（Ampr）转化大肠杆菌MG1655；

(2)根据aceE基因及pKD3的基因序列设计并化学合成引物MaceE-F和MaceE-R；

(3)以pKD3为模板使用(2)中引物进行PCR扩增，得到打靶片段MaceE；

(4)将打靶片段MaceE电击转化进入大肠杆菌MG1655敲除aceE基因；

(5)根据抗性及营养缺陷表型筛选及PCR验证同源基因双交换阻断突变株；

(6)对突变株进行发酵性能验证。

其特征在于所述引物MaceE-F和MaceE-R序列分别包含aceE基因中的一段序列。

其特征在于所述引物MaceE-F和MaceE-R如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。

其特征在于所述抗性表型是氯霉素抗性。

其特征在于所述营养缺陷表型是乙酸盐依赖型。

其特征在于所述的乙酸盐是乙酸甲。

其特征在于所述PCR验证引物aceE-F和aceE-R序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。

其特征在于敲除前和敲除后的aceE基因片段见SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6。