[发明专利]一种洋桔梗小孢子诱导获得单倍体植株的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种洋桔梗游离小孢子诱导获得单倍体植株的方法，属于花卉育种技术领域。

背景技术

洋桔梗（Eustoma grandiflorum），又名草原龙胆，为龙胆科草原龙胆属植物，花姿雅丽，花形别致，花色丰富，娇而不艳，瓶插期长、耐长途运输，茎杆光滑挺直，叶片油绿，具有较高的观赏价值和经济价值，是世界上十分流行的高档切花之一，现已跻身世界十大切花之列。

洋桔梗是异花授粉植物，容易授粉，种子量多，自交存在衰退现象， 但自交系之间杂交种（F₁）表现出强杂种优势，因此，国外引进洋桔梗品种F₁代杂交种子后代分离严重，不能留种种植。在我国，每年都需从国外大量进口洋桔梗种苗，从而导致洋桔梗生产成本高，为此，培育我国具有自主知识产权的洋桔梗新品种具有重大意义。

在杂种优势利用中，亲本必须是纯合的自交系，经组配后才能得到性状整齐一致具有强杂种优势的杂交种。洋桔梗采用常规的育种方法选育自交系，获得一个纯系大约需要6～8年，时间长，选择效率低，耗费大量的人力和物力，再加之洋桔梗为异花授粉，存在自交衰退现象，从而导致洋桔梗自交系的获得较困难。植物的花粉只带有一套染色体，是单倍性细胞，通过未成熟花粉（小孢子）培养可以获得单倍体植株，进而通过染色体加倍成为双单倍体材料（二倍体纯系），一方面有利于隐性突变或基因重组性状的表达，另一方面可以直接获得纯合自交系材料，应用于组配杂交种。

通常由小孢子培养来获得纯合材料仅需要1～2年时间，大大缩短自交系选育年限，加速育种进程，提高育种效率，是现代植物育种中快速、高效的育种途径之一。国内外已有利用小孢子培养获得植物自交系的报导，但未见洋桔梗小孢子培养获得单倍体自交系的报导。

尽管洋桔梗的花药培养获得再生植株的方法已经有报导（专利号：201010133937，王丽花等，洋桔梗花药离体培养与完整植株的诱导，西南农业学报，2009，22(5): 1424-1427），他们实验结果表明：通过花药培养获得的再生株群体的倍性组成比较复杂，以二倍体为主，单倍体所占比例较小，如何提高花药植株的单倍体再生比率须待进一步研究。我们通过文献检索，发现通过花药培养获得的再生植株绝大部分是来自于花药壁的二倍体细胞，也有可能少量来自单倍性的花粉粒，因此，单倍体出现的频率很低，甚至没有，因而，不能形成足够的选择群体，同时也导致再生植株混杂（混倍），要从这样的混杂植株中再挑选出单倍体植株费工费时。由此可见，采用花药培养对洋桔梗F₁代种子生产价值不大。

进一步开展洋桔梗小孢子培养技术研究，对解决我国洋桔梗杂交种子生产问题，具有巨大的潜在商业价值，同时，单倍体植株也是进行分子标记、遗传图谱构建、重要性状相关基因定位和分子克隆、遗传工程中遗传转化等的理想受体材料。

发明内容

本发明的目的在于针对洋桔梗杂交种子后代分离严重，难于得到自交系亲本植株的技术难题，提供一种高效、实用的洋桔梗单倍体培育方法，为洋桔梗品种改良和新品种选育提供优良的亲本自交系材料，解决洋桔梗杂交种子（F₁）依赖进口，鲜切花生产成本高等问题，该方法能快速稳定获得大量单倍体植株。

本发明进一步研究认为：由于游离小孢子的单细胞性、单倍性及大群体等特性，使其在单倍体育种上，较花药培养具有更多的优点：数量多、速度快、世代间基因型稳定，可完全避免花药壁二倍体细胞的干扰，获得完全真实的单倍体植株（可获得100%单倍体植株），加倍后可获得稳定的、高度纯合的二倍体纯系，为杂种优势利用提供亲本，应用于杂交制种能快速获得性状整齐具有杂种优势的F₁代杂交种。

为了实现上述目标，本发明采取如下的技术方案：

    （1）确定材料：选取具有综合优良性状的杂交一代洋桔梗品种作为试验材料；

    （2）花蕾选取，预处理，消毒：在开花初期，通过荧光染色法在显微镜下选取处于单核靠边期的花蕾，放入塑料袋中置于4℃冰箱1～3天，用洗洁精清洗花蕾表面，并用清水冲洗干净；用75%酒精消毒60sec，再用0.1%的升汞消毒10～15 min，最后用无菌水冲洗3次后，晾干；