[发明专利]新风胶囊水溶性蛋白分子量检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及中药类水溶性蛋白分子量的检测领域，具体是涉及一种新风胶囊水溶性蛋白分子量检测方法。

背景技术

新风胶囊系安徽中医学院第一附属医院的医院制剂(皖药制Z20050062)，该药由黄芪、薏苡仁、雷公藤和蜈蚣4味中药组成，具有益气健脾，化湿通络之功效，具有广阔的开发前景。

随着分子生物学的快速发展及应用，为中药的质量控制提供了新的思路。由于中药主要来源于动植物等生物体，其细胞内都含有受遗传基因调控、代表其品种特征性的蛋白质分子，不同蛋白质的分子大小、空间结构和电荷数目上的差异，可以通过电泳得到分离。因此，应用现代分子生物学的原理和方法，将中药制剂质量评价技术从形态、组织、细胞推进到分子水平，对中药制剂中蛋白质成分分析，可以解决目前中药制剂鉴定以及内在质量评价的难题。

发明内容

针对现有技术中存在的技术问题，本发明提供了一种新风胶囊水溶性蛋白分子量检测方法，将SDS-PAGE电泳方法应用于新风胶囊中水溶性蛋白成分测定，为建立该制剂电泳特征图谱提供依据。

为了实现上述目的，采用的技术方案如下：

新风胶囊水溶性蛋白分子量检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

①、试剂的配制

电极缓冲液，称取甘氨酸5.0g、三羟甲基氨基甲烷3.0g，十二烷基磺酸钠1.0g，加适量双蒸水溶解后，用1mol/l盐酸调pH至8.3，然后加双蒸水至1000ml，置于4℃保存；

固定液，称取三氯醋酸5.0g，加双蒸水200ml溶解后，加甲醇200ml，再加双蒸水至500ml；

考马斯亮蓝脱色液，量取乙醇400ml、冰醋酸100ml与双蒸水500ml，混匀；

1％琼脂糖溶液，称取琼脂糖0.2g，加电极缓冲液20ml，加热溶解成澄清溶液；

10％过硫酸铵溶液，称取过硫酸铵0.1g，加1ml双蒸水溶解至澄清；

②、供试品溶液的制备

取新风胶囊内容物5.0g，于研钵中研成细粉，加6ml 1M Tris-HCl缓冲液溶解，研匀，静置5min，4000r/min离心20min，吸取上清液900μl，加300μl 4×蛋白质上样缓冲液混合，沸水浴5min，以12000r/min离心20min，冷却后吸取上清液分装，每管分装20μl，-20℃贮存；

③、电泳槽的安装

电泳槽的各部件在组装前均需清洗干净，选择水平操作台面，首先将白色内芯放入黑色内槽中，然后将电泳玻璃采取凹形玻璃板在白色内芯内侧、矩形玻璃板在白色内芯外侧的方向，顺着白色内芯一侧的胶条小心放入内芯；

当两侧的玻璃全部放入到白色内芯后，确认凹、平板的底部边缘均与黑色内槽密封槽平齐，旋紧紧固旋钮；

用移液枪吸取1％琼脂糖溶液，沿密封槽一端灌入封闭玻璃板，为防止留存气泡，稍抬起一端赶去气泡，琼脂糖溶液需进入胶室0.9～1.1cm，凝固5～7min后进行灌胶操作；

④、凝胶的制备

按4ml 1.5M Tris-HCl缓冲液、6.7ml 30％丙烯酰胺、1.6ml 1％十二烷基磺酸钠、0.1ml 10％四甲基乙二胺、0.1ml 10％过硫酸铵和3.3ml双蒸水配制12.5％分离胶溶液，然后开始灌胶，并防止气泡产生，水封室温下聚合；

待分离胶溶液聚合后，用滤纸吸取上面的水层，再灌入4.5％浓缩胶溶液，并插上样品梳，4.5％浓缩胶溶液按1.35ml 30％丙烯酰胺、0.9ml 1％十二烷基磺酸钠、0.07ml 10％四甲基乙二胺、0.07ml 10％过硫酸铵、2.25ml 1M Tris-HCl缓冲液和4.33ml双蒸水配制；

⑤、上样与电泳

待浓缩胶溶液聚合后，双手轻取出梳子，提住白色把手将黑色内槽放入外槽中，用微量注射器吸取样品提取液5μl，缓缓注入加样孔中，动作要轻，不能破坏胶面；

在黑色内槽内部和外部分别加注电极缓冲液，内部液面高度要高过凹板下沿10mm，外部液面高度为外槽的1/3；

盖上安全盖，接通电泳仪，80v电压1小时后，待溴酚蓝示踪指示剂前沿到达分离胶上沿时，把电压调至100v，待示踪指示剂行至距琼脂层0.9～1.1cm时，关闭电源，停止电泳，整个电泳过程需要3～4个小时；

⑥、染色与脱色

电泳结束后，打开电泳槽，取出凝胶，切去浓缩胶，保留分离胶并标记溴酚蓝前沿，置固定液中固定半小时后，取凝胶放入适量考马斯亮蓝染色液中，确保染色液可以充分覆盖凝胶，置于水平摇床上缓慢摇动，室温染色1.5～2.5小时；