[发明专利]南方菜豆花叶病毒的RT-LAMP检测试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

 本发明涉及南方菜豆花叶病毒的检测技术，具体涉及南方菜豆花叶病毒的RT-LAMP检测试剂盒及检测方法。

背景技术

南方菜豆花叶病毒（Southern bean mosaic virus, SBMV）是南方菜豆花叶病毒属（Sobemovirus）的典型成员，主要分布在美洲和非洲的温热带地区，法国和亚洲的印度也有报道，该病毒主要通过豆科作物的种子进行远距离传播。目前检测南方菜豆花叶病毒的方法主要包括血清学检测、逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）技术和实时荧光RT-PCR检测技术等。血清学方法需要制备血清，较为繁琐，且检测周期长，并因南方菜豆花叶病毒存在不同株系易导致漏检现象。RT-PCR技术需对PCR产物进行开盖处理，易发生交叉污染，造成假阳性现象。实时荧光RT-PCR技术需要昂贵的检测设备，检测成本较高，不适合基层和小型实验室推广使用。

环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification, LAMP）作为一种新颖的核酸扩增方法，同样具有检测速度快、操作简单和灵敏度高等优点；该技术依赖于能够识别靶序列上6个特异区域的引物和一种具有链置换特性的Bst DNA聚合酶，在等温条件下可高效、快速和特异地扩增靶序列。由于LAMP呈瀑布式扩增，因此其扩增效率非常高；同时，LAMP识别靶序列上的6～8个特异性位点，其特异性也很强；LAMP只在60℃～65℃进行恒温扩增，只要水浴锅即可，无需特殊的仪器，操作非常简单；而且LAMP的整个检测反应只需1 h左右，检测周期非常短。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种检测速度快、操作简单、检测结果判断容易和灵敏度高的南方菜豆花叶病毒的RT-LAMP检测试剂盒；并提供了南方菜豆花叶病毒的RT-LAMP检测方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：南方菜豆花叶病毒的RT-LAMP检测试剂盒，该检测试剂盒包括2×反应缓冲液，浓度8 U/μL 的Bst DNA聚合酶液，浓度为20μM的内侧上游引物、内侧下游引物、外侧上游引物和外侧下游引物， 钙黄绿素荧光染料（购自Eiken公司），所述2×反应缓冲液与Bst DNA聚合酶液、内侧上游引物、内侧下游引物、外侧上游引物、外侧下游引物、钙黄绿素荧光染料的体积比为12.5：1：2：2：0.25：0.25：1，所述内侧上游引物的核苷酸序列为5’- CGCCAACAGC CGTTGTGAAA TCGTTGGACA GCTTGGCAAG A-3’，所述内侧下游引物的核苷酸序列为5’- TGGTCCCGGC GAGGCTTATA AGCGTCCAGT ACTCACAGC-3’，所述外侧上游引物的核苷酸序列为5’- ACGGCCAATG CTATCACG-3’，所述外侧下游引物的核苷酸序列为5’- GCAGTGGGCT CTATCAGTTG-3’。

南方菜豆花叶病毒的RT-LAMP检测方法，其步骤如下：

a、总RNA提取：0.1 g检测样品经液氮处理后研碎成粉末状，用Trizol核酸提取试剂提取总RNA，得到样品总RNA；具体提取方法依Trizol核酸提取试剂的说明书进行；

 b、RT-LAMP扩增：RT-LAMP扩增反应体系为2×反应缓冲液12.5μL，浓度8 U/μL 的Bst DNA聚合酶液1.0μL，钙黄绿素荧光染料1.0μL，浓度为20μM的内侧上游引物和内侧下游引物各2.0μL，浓度为20μM的外侧上游引物和外侧下游引物各0.25 μL，样品总RNA2.5μL，无RNase的水补至25μL，反应条件为恒温63℃的水浴锅中扩增1 h，再95℃ 2 min，得到扩增产物； 

c、判断：在自然光照条件下，肉眼观察扩增产物颜色，若扩增产物呈黄绿色，则样品感染南方菜豆花叶病毒，若扩增产物呈橙色，则样品中无南方菜豆花叶病毒。