[发明专利]检测膀胱癌尿液miRNA-155的专用引物、试剂盒及方法

权利要求书

1.一种检测膀胱癌尿液miRNA-155的专用引物，其特征在于，包括：

（1）miRNA-155的逆转录引物和检测引物，逆转录引物的序列如SEQ ID NO：1所示，检测引物的序列如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示：

miRNA-155-RT：

5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACCCCT-3’；

miRNA-155-F：5’-CGCCTTAATGCTAATCGTGAT-3’；

miRNA-155-R：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；

（2）miRNA-191的逆转录引物和检测引物，逆转录引物的序列如SEQ ID NO：4所示，检测引物的序列如SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6所示：

miRNA-191-RT：

5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCAGCTG-3’；

miRNA-191-F：5’-GCCAACGGAATCCCAAAAG-3’；

miRNA-191-R：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；

（3）miRNA-16的逆转录引物和检测引物，逆转录引物的序列如SEQ ID NO：7所示，检测引物的序列如SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9所示：

miRNA-16-RT：

5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGCCAA-3’；

miRNA-16-F：5’-CGCCTAGCAGCACGTAAATA-3’；

miRNA-16-R：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’。

2.一种检测膀胱癌尿液miRNA-155的专用试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的专用引物，以及RNA分离液；所述RNA分离液由吐温20、三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、牛血清白蛋白和水组成，其中，浓度如下：吐温20：2.5%，三羟甲基氨基甲烷：50mmol/L，乙二胺四乙酸：1mmol/L，牛血清白蛋白：1%。

3.根据权利要求2所述的一种检测膀胱癌尿液miRNA-155的专用试剂盒，其特征在于，所述专用试剂盒还包括PCR反应液，所述PCR反应液由Syber Green Ⅰ荧光染料、DNA聚合酶、dNTPs、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、氯化钾、氯化镁和水组成。

4.根据权利要求3所述的一种检测膀胱癌尿液miRNA-155的专用试剂盒，其特征在于，各物质的浓度如下：DNA聚合酶：100U/mL；dNTPs：0.2mM；氯化镁：6mM；三羟甲基氨基甲烷盐酸盐：16.5mM；氯化钾：89.3mM。

5.权利要求1所述的检测膀胱癌尿液miRNA-155的专用引物在定量检测膀胱癌miRNA-155表达量的应用。

6.权利要求3所述的检测膀胱癌尿液miRNA-155的专用试剂盒在定量检测膀胱癌miRNA-155表达量的应用。

7.一种检测膀胱癌尿液miRNA-155表达量的方法，其特征在于，步骤如下：

（1）分离尿液标本上清液，与等体积的RNA分离液混合，离心，分离上清；

（2）RT-PCR扩增：将上述分离的上清液进行反转录成cDNA，取cDNA为模板，加入引物和PCR反应液，进行PCR反应，检测样本阈值Cq；同时以人膀胱癌细胞株T24细胞中提取miRNAs，逆转录成cDNA作为校对样本，在每个PCR反应板中进行检测，记录Cq值；内参基因miRNA-191、miRNA-16的RT-PCR扩增，除引物采用相对应的逆转录引物和检测引物外，方法相同；

（3）制作标准曲线：上述检测完成后，拷贝数以10为底取对数作为横坐标，Cq值为纵坐标作图，绘制标准曲线，计算斜率S，然后根据公式E=10^（-1/S）-1，计算扩增效率E；

（4）计算：选中样本和校对样本检测孔，应用实时荧光定量PCR仪的随机软件得出样本阈值Cq（T）和校对样本阈值Cq（C），根据公式Q=（E+1）^-△Cq，△Cq=[Cq（T）-Cq（C）]，得出基因的校正起始拷贝数Q；将miRNA-155的Q值与内参基因miRNA-191、miRNA-16的Q值的几何平均数相比，得到miRNA-155的相对表达量。