[发明专利]一种用于禽肺病毒C亚群特异性检测的荧光定量RT-PCR检测试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种荧光定量RT-PCR检测试剂盒，特别涉及一种用于禽肺病毒C亚群特异性检测的荧光定量RT-PCR试剂盒及其应用，属于病毒检测领域。

背景技术

C亚型禽肺病毒（APV/C）是在1997年于美国科罗拉多州的发病火鸡群中分离得到。APV属于副粘病毒科，肺病毒亚科，偏肺病毒亚属。根据其G基因的不同将欧洲病毒株分为A、B、C、D四个亚型。C亚型G基因与A和B亚型的同源性较低，且比A和B的G基因序列要长很多。APV的M蛋白高度保守，A和B亚型M蛋白的同源性为89%，但C亚型与A和B亚型M蛋白的同源性分别为78%和77%，APV/C亚型与APV/A和APV/B亚型F蛋白的同源性为83%，因此，美国流行的APV/C亚型与欧洲流行的APV/A和APV/B亚型有着显著的不同，但APV/C亚型与人偏肺病毒（HMPV）核酸序列相似。虽然在中国没有关于APV/C亚型的报道，且美国与中国地理位置上距离远，但中国和美国养禽业进出口贸易频繁，很有可能对中国的养禽业造成危害。另外，中国的临近国韩国已有对APV/C亚型的报道，因此建立一种针对APV/C亚型的快速、灵敏的诊断方法对APV快速检测、预防具有重要意义。

本研究为针对C亚群APV检测的荧光定量RT-PCR的检测试剂盒及其应用，本发明的检测试剂盒具有良好的敏感性和特异性，方便快捷且同时能够区分亚群，为APV的临床检测、流行病学调查奠定了基础。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种用于禽肺病毒（Avian pneumovirus,APV）C亚群特异性检测的荧光定量RT-PCR检测试剂盒。

为达到以上目的，本发明采用的技术手段为：

根据GenBank中，禽肺病毒（APV）C亚群序列设计1对针对G基因的引物和1条特异性TaqMan探针，建立了一种快速检测APV C亚群病毒载量的特异性TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法并组装了试剂盒。通过对反应条件和反应体系的优化，使得使用本发明试剂盒进行的荧光定量RT-PCR检测在1×10³～1×10⁹个拷贝·μL^-1范围内具有良好的线性关系，灵敏度达到10²个拷贝·μL^-1，是常规RT-PCR方法的100倍，而且与常规RT-PCR方法相比（-AUBOYER M,JESTIN V，TOQUIN D,et al Comparison of F-,G-and N-based RT-PCR protocols with conventional virological procedures for the detection and typing of turkey rhinotracheitis virus.A rch Virol，1999,144:1091-1109；或DAR A M,TUNE K,MUNIR S,et al,PCR-based detection of an emerging avian pneumovirus in US turkey flocks,J Vet Diagn Invest，2001,13(3):201-205；或GHARAIBEH1S M,ALGHARAIBEHG R,Serological and Molecular Detection of Avian Pneumovirus in Chickens with Respiratory Disease in Jordan,Poultry science，2007,86（6）:1677-1681），使用本发明试剂盒进行的荧光定量RT-PCR检测可对结果进行实时监控，无需进一步进行凝胶电泳分析。试验表明，使用本发明试剂盒进行的荧光定量RT-PCR检测与其他禽病病毒无交叉反应，且C亚群的荧光定量RT-PCR与其他亚群的RNA标准品不反应，说明本发明试剂盒具有良好的敏感性和特异性。将备检样品提取RNA后，不用反转录，直接进行荧光定量RT-PCR反应，利用所建立的荧光定量RT-PCR检测试剂盒可以在2h内快速准确地对APV C亚群进行检测，既能进行定性检测，又能准确定量，而且能够将阳性样品的亚群进行准确的判断。

本发明一种用于禽肺病毒C亚群特异性检测的荧光定量RT-PCR试剂盒，其特征在于包括特异性扩增禽肺病毒C亚群G基因的特异性引物对和探针，其中所述的引物对中两条引物的核苷酸序列分别如下所示：

上游引物：5'GGGCTAGTCAGCTTTGAACTC3'（SEQ ID NO.1所示）