[发明专利]一种混合菌株发酵生产茶籽粕饲料的方法

说明书

技术领域:

本发明涉及一种发酵生产茶籽粕的方法，具体涉及一种利用面包乳杆菌（Lactobacillus crustorum）与纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）混合发酵生产茶籽粕饲料的方法。

背景技术:

皂苷的毒性主要表现为溶血性，一般认为，溶血性是其苷元可以与红细胞壁上胆甾醇结合生成不溶于水的复合物沉淀，破坏细胞渗透压，使红细胞发生崩解，进而导致溶血现象。皂苷有无溶血活性与皂苷元有关，活性强弱与糖分子的大小、糖分子之间的连接、糖分子上的取代基等有关，此外还与皂苷的浓度有关。

茶皂素的结构如附图1所示，属于三萜类皂苷，由糖体、配基和有机酸组成。从分子结构看，茶皂素是一种非离子表面活性剂。其亲水基团由强电负性的含氧基团组成，这些基团集中在茶皂素的糖体配体，有机酸配体及皂苷配基的连接部位，构成亲水部分。其中配基是由非极性的碳氢环链构成，在水溶液中呈现憎水的倾向，成为亲油的主体，所以茶皂素的结构分为亲水和亲油两部分。Sobolewska等在发表于2010年9月（9卷，3期）《Phytochemistry Review》（植物化学评论）425～474页的《Saponins as cytotoxic agents:a review》（综述：皂苷—细胞毒素）一文中称利用酶解法去除皂苷的糖体配体，会降低皂苷的溶血性。酶水解工业化应用成本较高，如能利用微生物发酵，以降低茶籽粕的毒性，将更有工业化应用前景。

茶籽粕的纤维素含量高，作为饲料适口性不好。纳豆芽孢杆菌可产高活性纤维素酶，降解原料中的纤维素；同时，乳酸菌可产一些风味成分，有利于提高产品的适口性。

发明内容:

本发明的目的在于提供两种发酵菌株，以及利用该菌株进行固态发酵生产茶籽粕饲料的方法，经发酵后使茶籽粕的溶血作用明显下降，降低了茶籽粕的毒性；降解了茶籽粕中的纤维素，利用面包乳杆菌发酵产生风味物质，提高饲料的适口性；利用纳豆芽孢杆菌发酵，使发酵、干燥后的茶籽粕中存在益生菌。

为解决上述问题，本发明采用以下技术方案：

一种面包乳杆菌菌株，其分类命名为面包乳杆菌（Lactobacillus crustorum)，其保藏编号为CGMCC NO.6304，保藏日期为2012年6月28日,保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

一种纳豆芽孢杆菌菌株，其分类命名为纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto），其保藏编号为CGMCC NO.2801，保藏日期为2008年12月9日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏单位地址为：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所。

本发明还公开了所述面包乳杆菌菌株与纳豆芽孢杆菌混合发酵茶籽粕生产茶籽粕饲料的方法，包括以下步骤：

1、种子培养：

（1）将所述面包乳杆菌菌株涂布于MRS固体培养基，然后于30～40℃厌氧培养2～3天，挑取单菌落接种到种子培养基A中，继续30～40℃厌氧培养,使菌液的OD₆₀₀值达到0.8±0.1，备用。所述种子培养基A成分为：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母抽提物5.0g，纤维二糖20.0g，吐温-801ml，柠檬酸三铵2.0g，K₂HPO₄2.0g，MgSO₄·7H₂00.2g，MnSO₄·2H₂O0.05g，蒸馏水1000ml。

（2）将上述的纳豆芽孢杆菌菌株涂布于LB固体培养基，将涂布好的平板30～40℃好氧培养1～2天，挑取单菌落接种到种子培养基B中，继续30～40℃培养12～24小时,使菌液的OD₆₀₀值达到0.8，备用。所述的种子培养基B成分为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，蒸馏水1000ml。

2、茶籽粕中加入适量的含一定量葡萄糖、半乳糖和硫酸铵的pH5.0的缓冲溶液，混合均匀后灭菌备用，得到茶籽粕发酵原料。

3、将步骤1中培养的面包乳杆菌与纳豆芽孢杆菌种子液分别接种于步骤2所述的茶籽粕发酵原料中，接种量均为菌液：茶籽粕等于3～10ml：100g。接种后的原料于30～40℃好氧发酵24～48小时，再于30～40℃厌氧发酵24～48小时，得发酵的茶籽粕饲料。