[发明专利]一种家蚕幼虫体1-脱氧野尻霉素含量的测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种家蚕幼虫体1-脱氧野尻霉素含量的测定方法。

背景技术

糖尿病是一种内分泌代谢紊乱的常见多发慢性病，临床症状主表现为高血糖。随着社会经济条件的改善和饮食结构的改变，近年来糖尿病的患病率大幅度增长，已成为当今医学上一个严重的公共卫生问题，给国民经济发展造成了很大的影响。目前临床上用于治疗糖尿病的药剂主要有胰岛素类、磺酰脲类、双胍类及α-糖苷酶抑制剂类这几类，胰岛素类、磺酰脲类、双胍类药物会引起肝损伤、血糖过低、水肿等，副作用较大，α-糖苷酶抑制剂为当前开发的重点领域。

1-脱氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，DNJ）是一种α-糖苷酶抑制剂，可竟争性地与α-糖苷酶结合，以阻害α-糖苷酶对二糖的水解，使二糖不能被水解成单糖进入血液内，而被直接送入大肠排泄，从而起到了有效降血糖的作用，是当前糖尿病治疗药物开发的一个崭新领域。国外学者对DNJ进行了大量的研究，人工化学合成出了许多衍生物，其中N-羟乙基-1-DNJ被开发成了治疗糖尿病的新药---格列米醇（也叫格列本醇），于1998年用于临床。但DNJ分子中具有多个（4个）手性中心，与其相关的立体异构体多达15种以上，人工化学合成的其衍生物在药理药效与毒副作用上与天然DNJ存在较大的差异，不能满足当今社会的高水平需求。

家蚕是当今地球上室内饲养量最大的经济资源昆虫，不仅资源丰富，而且活性物质与营养成分充足，很适宜作为高效、安全生物反应器用于开发生产附价值高、发展前景广阔的活性药物。家蚕幼虫体具有高效合成与富集DNJ的特性，不仅DNJ含量高，而且降血糖效果显著，可用于糖尿病治疗药物和保健食品的开发。

发明内容

本发明的目的在于提供一种家蚕幼虫体1-脱氧野尻霉素含量的测定方法，是用9-芴基氯甲酸甲酯（FMOC-Cl）标记DNJ，在配有荧光检测器的反相高效液相色谱检测，建立精确、稳定的家蚕幼虫体DNJ含量检测方法。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：

1）家蚕幼虫于-50℃下真空干燥36 h，于-15℃下超微粉碎10~15 min，过80~100目筛，得到家蚕幼虫粉；

2）取家蚕幼虫体粉，按重量体积比为1：700~800比例，加入0.05 mol/L HCl，常温下涡流15~20 s并超声波处理20~30 min后，用21690 g离心20 min，收集上清液，沉淀物再按上述步骤提取一次，合并两次上清液，定容得供试液；

3）取10 μL供试液，与10 μL 0.4 mol/L、pH8.5的硼酸钾缓冲液混和，加入20 μL 5 mmol/L FMOC-Cl液，混匀并在20℃水浴锅中反应20~25 min，加10 μL 0.1mol/L甘氨酸液，中和剩余的FMOC-Cl来终止反应；

4）反应液用950 μL质量百分比为 0.1%醋酸液稀释，生成的DNJ-FMOC，并用孔径0.2 μm尼龙吸管式过滤器过滤，得测定液；

5）将10 μL测定液用进样器注入色谱柱为DIAMONSIC C₁₈柱的Waters 600高效液相色谱仪，以体积比为1：1的乙腈-0.1%醋酸为流动相，按1.0 mL/min流速在常温下洗脱；

6）用激发光254 nm、发射光322 nm 的Waters 474荧光检测器检测洗脱曲线，根据DNJ-FMOC色谱峰面积按回归方程Y=0.0002X+ 2.9815计算出1-脱氧野尻霉素含量。

本发明具有的有益效果是：

本发明建立的家蚕幼虫体1-脱氧野尻霉素含量测定方法，精密度、重现性与加样回收率高，稳定地好，可用于大数量家蚕幼虫制品中DNJ含量的检测，这对于推进家蚕幼虫体的药用开发，具有积极的社会效益和经济效益。

具体实施方式

实施例1：