[发明专利]一种肺炎支原体抗原、制备方法以及免疫检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及肺炎支原体(MP)黏附蛋白1(P1)密码子优化基因、其抗原、其抗原组合物，还涉及含有该抗原或抗原组合物的试剂盒和应用。

背景技术

肺炎支原体(Mycoplasma pneumonia，MP)感染在临床上引起非典型肺炎和支气管炎，严重者可以导致呼吸道以外的并发症，如急性弥散性脑脊髓炎、血液系统、运动系统损害等，感染对象多为5岁以下的儿童。MP引发的肺炎与其他病原引发的肺炎症状相似，但MP没有细胞壁结构，临床用药主要采用以可渗入细胞内的大环内酯类抗生素，如罗红霉素、红霉素、阿奇霉素等，而对常规肺炎治疗采用的抗生素类药物，如青霉素、头孢等(主要是抑制病原体细胞壁合成类药物)，并不敏感。因此，MP的鉴别诊断对临床合理用药具有很好的指导意义。

目前MP的实验室检测主要有分离培养法、血清学检测、核酸检测。分离培养法是MP检测的金标准法，但由于MP生长缓慢，周期长，且阳性率低，无法作为临床常规检测手段。核酸检测主要针对患者咽拭子、痰液、肺泡灌洗液等样本，经洗涤、离心等处理后获得的模板进行PCR扩增检测，具有时间短、灵敏度特异性高等优点，但对操作人员要求高，且样品易污染，仪器设备昂贵，限制了其进一步应用。

目前临床主要采用日本研制的凝集试验，主要原理是利用明胶粒子和提取的MP抗原结合，对患者血清中MP特异抗体的进行检测。该方法简单实用，但无法区分IgM、IgG抗体。实事上，IgM抗体出现要早于IgG抗体，是MP急性感染的重要标记物。尽管目前存在针对IgM-ELISA试剂盒，但由于缺少对MP抗原表位的深入研究，试剂盒灵敏度特异性差，难以达到临床检测的标准。

MP基因组为双链环状DNA，全长816394bp，编码上百种蛋白。黏附是MP致病和感染的先决条件，引发这一过程的是MP顶端的“黏附蛋白复合体”介导，其中黏附蛋白P1除了在MP感染和致病过程中发挥重要的作用外，还是重要的免疫原。刺激机体产生强烈的免疫应答、具有很好的免疫原和抗原性，是诊断抗原研究的重要靶点。P1蛋白由1627个氨基酸组成，相对分子量约为176.8kD。Chaudhry针对P1抗原表位的研究显示：位于C末端的1160-1521aa具有较好的免疫反应性，能与72.7％(24/33)的阳性血清发生反应，与32份阴性血清的特异性为100％；而位于N末端的60-180aa并没有抗原活性。针对P1蛋白C末端的抗原表位进行生物信息学预测，筛选并表达了1154-1521aa区段抗原，灵敏度和特异性分别为55.6％(20/36)和100％(45/45)，但对P1蛋白N端及中间部位的抗原表位情况并不清楚。

不同于其他病原体，MP采用不同于独特的偏性密码子系统，通用的终止密码子UGA在MP中编码色氨酸，如果直接采用MP的野生基因能造成蛋白翻译的中断，限制了重组MP抗原的研制。目前重组MP抗原的克隆表达通常规避UGA，获得的多为不含色氨酸的片段抗原，缺少对抗原表位有效的预测和筛选，或是直接采用灭活的全菌体提取抗原，直接影响后期MP检测试剂的研制。

发明内容

为了获得具有诊断意义的重组MP抗原，本发明针对MP黏附蛋白P1的报道较少的90-1099aa抗原区间进行生物信息学表位预测，获得其中可能与患者血清发生免疫反应的抗原片段的氨基酸序列。

为了克服野生MP基因密码子偏性的问题，本发明采用大肠杆菌优势密码子反向翻译上述抗原的氨基酸序列，获得由大肠杆菌优势密码子组成的全新MP抗原基因，其基因序列如序列表中序列1-6所示，并采用退火延伸PCR技术获得改造后的MP基因。

采用基因重组技术对上述MP基因进行克隆表达，获得高表达的MP抗原，以此重组抗原为基础建立IgM捕获法MP-ELISA检测试剂，并评价其MP检测中的诊断意义。

本发明的目的是提供肺炎支原体P1黏附蛋白90-1099aa区间抗原表位的位置。本发明另一目的提供有大肠杆菌优势密码子组成的上述抗原表位基因本发明提供了在上述基因基础获得的MP重组抗原及其抗原组合物。本发明还提供了在上述抗原及其组合物基础上建立的肺炎支原体P1-IgM抗体检测试剂盒，该试剂盒实现了在肺炎支原体感染早期进行准确检验的目的。