[发明专利]一种葡萄球菌肠毒素基因工程重构抗体及制备方法及用途

说明书

技术领域

本发明涉及重组抗体，特别涉及一种葡萄球菌肠毒素基因工程重构抗体及制备方法及用途。 

背景技术

金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus，SA)是一种人畜共患病的重要致病菌,是国内外最常见的细菌性食物中毒病原之一。该菌广泛分布于自然界中，包括空气、水、尘埃及人和动物的排泄物中,尤其食品极易受污染，其引起的食物中毒临床表现主要以恶心、呕吐和腹痛为主，少数病人有腹泻、头痛、头晕、发热、脱水等症状。迄今，世界诸多国家都曾相继报道金黄色葡萄球菌的暴发流行，不但严重危害人类健康，且直接间接经济损失巨大。金黄色葡萄球菌的强致病性主要取决于耐热毒素和相关酶类物质的产生能力，其中葡萄球菌肠毒素(Staphylococcal enterotoxins,SEs)作用至关重要。葡萄球菌肠毒素为一类结构相关、毒力相似、抗原性不同的细胞外毒素，分子量低（22-24KDa），易溶于水和盐溶液，不受胰蛋白酶影响，可耐受100℃煮沸30min而不被破坏。自从1959年葡萄球菌肠毒素被证实以来，已获得肠毒素类型共21种，根据血清学特征分类，包括早为人类发现和熟知的五种肠毒素SEA,SEB,SEC（C型又可分为C1、C2和C3三亚型）,SED,SEE和毒性休克综合症毒素Ⅰ（Toxic shock syndrome toxin-1,TSST-1,既SEF）,以及近几年相继发现的SEG，SEH,SEI,SEJ,SEK,SEL,SEM,SEN,SEO,SEP，SEQ,SER,SET，SEU等多种新型肠毒素。研究表明，并非所有的肠毒素都能在食物中毒中起作用，其中以SEA和SED最常见，并以SEA毒力最强，摄入1μg即能引起中毒。虽然已从基因水平对传统及新型肠毒素加以区分，但关于其毒素蛋白及功能的研究甚少，尚无借鉴资料，因此广泛获得不同动物及动物性食品中葡萄球菌株，提纯天然肠毒素蛋白，可为研究葡萄球菌肠毒素检测方法及其功能活性奠定基础，对丰富其认识亦有重要意义。目前，葡萄球菌肠毒素导致食物中毒机制有待于进一步证实，从免疫机制研究，可能与其介导大量细胞因子释放而引起多器官损害有关。与此同时，作为第一个被发现的超抗原，其独特高效的诱导机体免疫机制依旧倍受关注。新生物构建技术与其固有生物特性的结合，葡萄球菌肠毒素研究及应用前景将更为广阔。 

现阶段，对于葡萄球菌肠毒素的检测、预防、治疗的方法和手段多基于免疫原理，随着分子生物学的进一步发展，抗体技术也逐步由细胞工程抗体(单克隆抗体)向基因工程抗体演替。基因工程抗体，又被称为第三代抗体，即应用基因工程技术将抗体基因重组并克隆到表达载体上，在宿主中表达并折叠成有功能的抗体分子。基因工程抗体具有分子小、免疫原性低、可塑性强及成本低等优点。此技术的基本原理是，首先从杂交瘤或免疫脾细胞、外周血淋巴细胞等中提取mRNA，逆转录成cDNA后，经PCR分别扩增出抗体的重链及轻链可变区基因，按特定方式连接克隆到表达载体后，表达、折叠成功能抗体分子，筛选出高表达的 细胞株，再用亲和层析等手段纯化抗体片段。基因工程抗体技术的着眼点在于尽量减少鼠源成分，保留原有抗体的亲和力和特异性。该技术既可以对完整抗体，又可以对抗体片段进行改造，且不受伦理和技术等因素的制约，发展迅速。 

单链抗体(Single chain Fv segment,scFv)是基因工程抗体技术重要应用产物，即将重链可变区和轻链可变区基因用寡聚核甘酸连接，经表达、折叠后形成只由重链和轻链可变区构成的新型的小分子抗体，大小仅为完整IgG的l/6,同时抗原结合位点没有发生变化，即保持完整的特异性。该抗体缺失Fc片段，减少了与FcR阳性细胞发生非特异性结合的可能性,最大限度地降低鼠源性蛋白的同时，降低了免疫变态反应的可能性。另外，其分子量小，有利于穿透肿瘤组织，并避免了传统制备方法中细胞杂交的过程，减少工作量，提高制备成功率。近年来已构建了多种类的表达载体，使单链抗体在真核细胞、原核细胞、噬菌体等表达系统中表达，其表达量、蛋白折叠及糖基化各具特点。通过抗体库展示技术，体外表达重组抗体已显示出广泛的临床应用前景，特别是寄生虫抗原表位、自身免疫疾病、基因治疗、肿瘤印象分析与治疗等方面。