[发明专利]一种古菌嗜热酯酶及(S)-酮洛芬的制备方法

说明书

技术领域

本发明设计一种古菌嗜热酯酶及其用于制备(S)-酮洛芬的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

2-芳基丙酸类药物（2-APA）属于非甾体消炎镇痛药（NSAIDS），是解热镇痛、消炎抗风湿的基本药物和主要产品，它是目前处方药和非处方药处方量最大的一类药物。常用的有布洛芬、奈普生和酮洛芬 3 种，其 α位有一个手性碳原子存在(S)-构型和(R)-构型一对光学对映体，临床上一般以外消旋体的形式供应。其中酮洛芬的消炎镇痛作用是阿司匹林的150倍，解热作用是阿司匹林的 100 倍，临床上用于治疗慢性类风湿性关节炎、变性性关节炎、外伤和术后疼痛等。药理实验表明，其(S)-异构体的消炎镇痛作用是外消旋酮洛芬的2倍，而(R)-异构体的活性很低，但有其他方面药用价值，它对牙周病的骨质疏松有治疗作用。

目前，(S)- 酮洛芬的制备方法主要有化学合成法和微生物酶法拆分。采用化学法合成(S)- 酮洛芬，一般先得到等量的一对对映体混合物(外消旋体),将其拆分是获得光学纯(S)- 酮洛芬。通常利用手性试剂将外消旋体混合物中一对对映体转化为两种非对映体,然后利用非对映体理化性质的差异,将其分开,但此拆分过程较繁杂,手性试剂昂贵,多数情况下难以得到满意的收率。采用微生物酶法拆分合成(S)- 酮洛芬，具有立体专一性强、拆分效率高、生产条件温和、无环境污染、反应步骤简单、不需手性源、生产成本低等诸多优点。目前，用于拆分(S)- 酮洛芬的酶多数是商品化的脂肪酶，而利用酯酶拆分合成(S)- 酮洛芬的方法还未建立。商品化的脂肪酶多数是在中温酶，反应pH也在中性左右，没有能够适应高温酸性条件下拆分合成(S)- 酮洛芬的脂肪酶。

发明内容

本发明要解决的技术问题是化学合成法制备（S）-酮洛芬收率低。提供一种古菌嗜热酯酶及其用于制备（S）-酮洛芬的方法。

本发明的技术方案是：一种古菌嗜热酯酶的制备方法，包括菌株、质粒、酶与培养基，PCR扩增及重组质粒的构建，基因的诱导表达与蛋白质的纯化，它的步骤如下：

（1）设计一对引物: 上游[5’-GCC CATATG GTT AAG CTG ATA ATC AAG-3’]，下游[5’-GAT GTCGAC TCACCTCTTCAAAAAGGAAAC-3’]，以Thermotoga maritima全基因组序列为模板进行扩增，用内切酶酶切后连接到经同样内切酶酶切的pET15b上，连接产物转化大肠杆菌E.coli DH5α，筛选重组质粒，进行双酶切及测序验证；

（2）基因的诱导表达与蛋白质的纯化：将重组质粒转化E. coli BL21-codonPlus(DE3)-RIL。加入0.5 mol/L IPTG于37℃继续培养4 h，诱导表达的蛋白经过70℃热处理30 min，镍柱亲和层析(洗脱缓冲液：20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 500 mM NaCl, 300 mM imidazole) 和分子筛Superdex-200 (16/60) column（洗脱缓冲液：50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 200 mM NaCl；洗脱速度为：0.5 ml/min）纯化后，得到古菌嗜热酯酶。

所述的古菌嗜热酯酶用于制备(S)-酮洛芬的方法，它的步骤如下：反应体系中底物酮洛芬乙酸酯 25 mg/ml，古菌嗜热酯酶0.235 mg/ml，1 ml 50 mM醋酸钠缓冲液，反应体系的pH为5-6，在反应温度60-80 ℃，200-250 rpm/min搅拌速度条件下下，水解反应10-60 h，得到(S)-酮洛芬。

该酶的最适酶活温度为70℃，最适酶活pH为5.0-5.5。该酶具有具有较好的嗜热性和耐酸性，是目前已发现少数古菌嗜热酯酶之一。

本发明的有益效果是：本发明得到了嗜热酯酶的基因序列和氨基酸序列，该酶是在Thermotoga maritima中发现并制备获得的第一个古菌嗜热酯酶；本发明获得了一种不同于现有技术的新的古菌嗜热酯酶；本发明获得了一种在高温酸性条件下酶法催化制备（S）-酮洛芬的新方法。