[发明专利]猪支原体肺炎疫苗专用稀释剂及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种专用于猪支原体肺炎疫苗的稀释剂，特别是一种能适用于猪支原体肺炎活疫苗和灭活疫苗、能特异性增强疫苗保护能力的猪支原体肺炎疫苗的稀释剂。

背景技术

猪支原体肺炎，俗称猪气喘病，是由猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)引起的一种猪的慢性呼吸道传染性疾病，主要症状为咳嗽和气喘。该病主要引起猪的饲料转化率下降和生长受阻，发病率高、死亡率低。猪支原体肺炎在世界范围内广泛流行，给现代养猪业造成重大经济损失。

猪支原体肺炎是一种顽固性慢性传染病，药物治疗效果不够理想，停药后容易复发，该病一旦在猪场流行, 就很难根除。因此，预防、控制和净化猪支原体肺炎须采取早期诊断、及时隔离、抗生素治疗或淘汰病猪、疫苗预防、全进全出、严格消毒等综合性措施，其中疫苗预防在控制猪支原体肺炎中起着关键性的作用。目前，国内外对于该病的防治主要依靠国外进口灭活疫苗，主要公司及产品包括美国辉瑞动物保健品公司开发的瑞倍适(RespiSure^?)、瑞倍适-旺(RespiSure^?One)、海博莱公司的喜可舒(MYPRAVAC SUIS^?)、先灵葆雅公司的安百克(M⁺PAC^?)、勃林格殷格翰公司的茵格发猪支原体肺炎灭活疫苗(Ingelvac ^?M.hyo)等等，其中以瑞倍适灭活疫苗应用最为广泛。

目前占领主导市场的灭活疫苗在临床使用上虽然显示出明显功效，但仍不能达到令人满意的完全保护效果。在研究中我们发现，由于体内自然感染和体外培养时的生长环境不同，猪肺炎支原体在体外无细胞培养条件下，有一些基因不能有效表达，而这些差异表达的蛋白往往与病原菌的感染过程密切相关。因此体外培养病原菌制备疫苗可能会缺失一部分重要的免疫原，使得保护谱不完全，不能达到类似动物感染康复后所获得的保护效果。P97蛋白是猪肺炎支原体的主要黏附因子，介导猪肺炎支原体侵入机体，继而诱发纤毛脱落炎症应答等病理变化。尤其是其中包含的重复片段区P97R1更被证明为猪肺炎支原体黏附细胞的关键区域。研究者将P97R1作为靶片段开发基因工程疫苗，可以使动物获得明显的攻毒保护能力，证明P97R1片段是猪肺炎支原体的重要免疫原，单独可诱导有效免疫保护效力。而同时，多项研究却发现免疫现有的几种商品化猪支原体肺炎灭活疫苗后猪体无法产生P97R1抗体，说明P97（含P97R1片段），无法在体外培养条件下大量表达，对P97R1抗原免疫的缺失成为现有猪支原体肺炎疫苗的一大缺陷。因此通过另外补充P97R1抗原将能进一步完善猪支原体肺炎疫苗的抗原谱，增强疫苗的免疫保护力。

基于此，本研究拟开发一种含有P97R1抗原的新型猪支原体肺炎疫苗稀释剂，通过添加P97R1抗原补充疫苗保护谱，同时采用制备免疫刺激复合物的方法增强P97R1及疫苗本身的细胞及体液免疫刺激能力。另一方面，该稀释剂还可能同时含有适用于猪支原体肺炎疫苗的其他水性佐剂成分，进一步提高疫苗免疫效力。

免疫刺激复合物（immunostimulating complex，ISCOM）是由Quil A（皂苷活性成分）、胆固醇、磷脂酰胆碱和抗原成分相互作用形成的纳米级笼状颗粒物。由于其含有免疫增强剂活性成分Quil A，同时为纳米级颗粒，因而能够有效激活机体免疫系统，显著增加嵌入抗原的免疫刺激能力。研究证明ISCOM能有效地活化辅助型T细胞和细胞毒性T细胞，促进细胞免疫应答，尤其是Th1型细胞免疫应答，同时也能够有效增强体液免疫应答水平。另一方面由于与胆固醇和磷脂酰胆碱相互作用后Quil A的毒副反应大大降低，因此ISCOM也具有良好的安全性。另外，研究发现将不含有抗原的免疫刺激复合物即免疫刺激复合物基质（ISCOM-matrix）和疫苗混合后也同样能够起到免疫佐剂的效果，因此我们将所制备的含ISCOM-P97R1的专用稀释剂溶解或稀释猪支原体肺炎疫苗，既能够获得对P97R1抗原的有效保护，同时也能够增强活疫苗和灭活疫苗本身的免疫刺激能力。

发明内容

本发明的主要目的在于公开一种专用于猪支原体肺炎疫苗的稀释剂，特别是一种能适用于猪支原体肺炎活疫苗、灭活疫苗，能特异性增强疫苗保护效力的猪支原体肺炎疫苗专用稀释剂。

本发明的另一个目的是为上述疫苗专用稀释剂提供一种操作简单方便的制备方法。

本发明的另一个目的是公开该疫苗稀释剂在猪支原体肺炎疫苗免疫中的应用。