[发明专利]人口腔鳞癌CAL-27耐药细胞株的培养方法及培养所得的细胞株

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种人口腔鳞癌CAL-27耐药细胞株的培养方法及培养所得的细胞株。

背景技术

在我国，口腔颌面部的恶性肿瘤以癌为最常见，肉瘤较少。在癌瘤中又以鳞状细胞癌为最多见，一般占80%以上；其次为腺性上皮癌（如黏液表皮样癌、腺癌、腺样囊性癌、恶性多形性腺瘤、腺泡细胞癌等）及未分化癌。鳞状细胞癌常向区域淋巴结转移，晚期可发生远处转移。针对鳞状细胞癌，虽然目前已经开发出了很多的治疗药物并且已经被有效应用于临床上，然而，在众多的化疗过程中经常遇到耐药和多药联用耐药的情况。耐药性一般由众多因素导致，其中不容忽视的是个体化基因的差异，差异基因的筛查与深入的耐药分子机制研究对未来的临床治疗有很深远的意义。传统诱导与筛选的方法建立的口腔鳞癌细胞株由于大剂量给药对细胞状态影响较大，造成差异基因的人为改变，不利于后期筛查。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为了克服目前常规方法筛选得到的人口腔鳞癌耐药细胞株容易因人为因素造成基因改变的缺陷，而利用人口腔鳞癌CAL-27细胞作为亲本细胞，选用临床常用肿瘤化疗药物作为筛选药物，在体外模拟人体体内给药后药物的真实作用过程，从而建立起一套稳定有效的耐药细胞株筛选体系和方法。

本发明提供的技术方案之一是：

一种人口腔鳞癌CAL-27耐药细胞株的培养方法，其包括如下步骤：

（1）在细胞培养皿中种植人口腔鳞癌CAL-27亲本细胞，细胞长至贴壁后待融合率达到30～40%时加入筛选药物，初始浓度采用该药物的IC₂₀值，连续作用24～72小时后洗去死细胞并扩增存活的细胞；

（2）待细胞重新处于对数生长期时，将细胞重复步骤（1）中所述洗去死细胞并扩增存活的细胞的操作，并将筛选药物的浓度提高一倍进行作用，在筛选药物的浓度提高至第一定值时，降低药物浓度增加倍数，在筛选药物的浓度加至第二定值时，将细胞经过冻存后复苏细胞，即制得人口腔鳞癌CAL-27耐药细胞株；所述第一定值的判断标准是指到该第一定值的下一个倍增值时，观察到细胞大量死亡，细胞状态变差，所述第二定值的判断标准是细胞在该第二定值的反复作用下能够正常生长，到该第二定值下一个倍增值时细胞增殖不受影响，细胞生长正常。

本发明中，步骤（1）较佳地在细胞长至贴壁后待融合率达到35～40%时加入筛选药物；步骤（1）较佳地在连续作用36～48小时后洗去死细胞并扩增存活的细胞；所述的筛选药物为临床上常用的肿瘤化疗药物，较佳地选自5-氟尿嘧啶（5-Fu）、顺铂（CDDP）和羟基喜树碱（HCPT）中的任一种；所述的药物的IC₂₀值为临床上常规的概念，指诱导肿瘤细胞凋亡20%时该药物的浓度。

本发明中，步骤（2）所述将细胞经过冻存后复苏细胞的操作较佳地为在细胞生长良好，细胞对药物耐受增加，基本不出现凋亡时，将细胞冻存3个月后复苏细胞。

本发明中，较佳地，在步骤（1）之前还包括如下步骤：

（a）取生长状态良好、处于对数生长期的人口腔鳞癌CAL-27细胞，用胰酶消化计数；

（b）在细胞培养容器中种植8组细胞，每组3个重复样品，每个样品加入细胞数为8000个，待细胞生长至贴壁；

（c）在含10%FBS的高糖DMEM完全培养基中添加步骤（1）所述筛选药物形成浓度梯度，并加入对应组别的样品细胞中，使该筛选药物对细胞发挥作用，待药物作用48小时后，加入MTT孵育4小时，然后加入三联溶解液（10％SDS，5％异丁醇，0.01mol/L HCl）溶解，取样于OD595nm检测读值，计算IC₅₀浓度，并根据IC₅₀浓度的值计算该筛选药物的IC₂₀浓度。

本发明中，步骤（a）所述用胰酶消化计数的操作中，所取的CAL-27细胞的数量与所用的胰酶数量之间的比例为本领域常规，只要胰酶能将待消化的细胞全部覆盖浸润即可；优选地，所取的CAL-27细胞的数量与所用的胰酶数量之间的比例为：每3×10⁶个细胞用1ml10mol/ml的胰酶消化。

本发明中，步骤（b）所述的细胞培养容器为本领域常规，优选96孔板。

本发明中，优选地，步骤（c）所述的筛选药物为5-氟尿嘧啶（5-Fu）、顺铂（CDDP）和羟基喜树碱（HCPT）中的任一种。