[发明专利]检测转基因水稻品系科丰8号的引物和探针、试剂盒和方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域。更具体地，本发明涉及用于通过实时PCR法检测转基因水稻品系科丰8号或其组分的引物和探针，包含所述引物和探针的试剂盒，以及利用所述引物和探针检测转基因水稻品系科丰8号成分或其组分的实时PCR检测方法。

背景技术

转基因生物是指利用生物技术，将外源基因转移到其它物种中以改造其遗传特性，从而获得人类所需的性状、营养品质而产生的生物新品种。以转基因生物或以其为原料加工而来的食品农产品就是转基因食品农产品。从1994年第一例转基因食品农产品(转基因番茄)在美国诞生至今，转基因生物已广泛进入食品饲料领域。

转基因抗虫水稻的培育

水稻(Oryza sativa L.)是中国最大宗粮食作物，年产量在2亿吨左右，约占中国粮食总产量的40％。水稻生产中的主要害虫为鳞翅目害虫，主要包括二化螟(Chilo suppressalis)、三化螟(Tryporyza incertulas)、稻纵卷叶螟(Chaphalocrocis medina)和大螟(Sesamia inferens)，以及属于同翅目害虫的褐飞虱(Milaparvata lugens，Stal)、白背飞虱(Sogatella furcifera，Horv6th)等，严重影响中国大米生产。培育转基因抗虫水稻是防治的有效途径。

苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白(Bacillus thringiensis insecticidal crystalprotein；Bt蛋白)，是苏云金杆菌芽孢形成过程中产生的伴胞晶体，该蛋白对鳞翅目和部分鞘翅目昆虫具高度特异的杀虫活性，在靶昆虫碱性肠道内溶解并经中肠蛋白酶的消化后，成为具有活性的毒性肽，与昆虫中肠的膜受体特异结合，形成跨膜离子通道，破坏消化道细胞的渗透压，最终致死昆虫。由于Bt蛋白在哺乳动物中无结合位点，且在人体内可被快速消化，因此对人和家畜无毒，在有机农业中已使用了50多年。

豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(Cowpea trypsin inhibitor，CpTI)是另一类常用的抗虫基因。在自然界CpTI主要存在于豇豆种子中，属于丝氨酸蛋白酶抑制剂家族，被害虫摄食后，CpT能抑制其肠道内胰蛋白酶的活性，同时产生厌食反馈信号，致使害虫进食减少，最终抑制其生长发育。

中科院遗传所与福建农科院等将密码子优化的Cry1Ac基因和CpTI基因转入水稻品种明恢86中，经自交选育获得转基因自交系科丰8号，经农业部批准进行了中间试验、环境释放和生产性试验，有望在不久的将来在农业生产上应用。

转基因食品的管理要求

已完成的安全试验和环境释放试验结果显示，转基因水稻具有食用安全和生态安全、抗虫效果优良等特点。作为食品或饲料，转基因作物与常规品种没有实质差别。但转基因食品农产品作为一种新技术产品，消费者仍忧虑其安全性。

世界上主要国家立法对转基因产品进行管理，美加、欧盟、日本、韩国、澳新的法律明确规定，转基因动植物品种需经政府批准，并经严格的生物安全、环境安全测试才可以田间种植、环境释放及作为食品、饲料，欧盟、日本、韩国、澳新等要求转基因食品进行标识，并规定了相应阈值水平。中国于2001年5月23日颁布《农业转基因生物安全管理条例》也有相应的安全管理规定。2002年3月20日开始实行的《农业转基因生物标识管理办法》也规定了转基因食品、农产品的标识制度。转基因产品检测是执法的关键措施之一，需要通过定性检测确定转基因的种类，鉴别其是否为已批准的或已获准用于食品、饲料、农产品，以防止具有风险的未知转基因产品的任意扩散，对社会产生危害；还需要通过定量检测确定转基因产品的含量，明确是否已达到所在国家规定的阈值水平，因为每个国家转基因标识的阈值水平都不相同。

转基因食品的检测方法

与蛋白表达具有组织特异性相比，核酸检测不受到材料种类的限制，且核酸比蛋白稳定，在加工食品、饲料、农产品中仍可检出，因此，食品、饲料、农产品的转基因检测中主要检测转基因核酸。

当外源基因插入到受体细胞染色体时，同时携有启动子、终止子、选择标记基因和报告基因，如花椰菜花叶病毒(CaMV)35s启动子，胭脂碱合酶NOS终止子等，核酸检测的靶标是插入的外源基因，包括外源基因的整合位点、启动子、终止子、选择基因的序列。

核酸的检测方法包括常规PCR方法和实时PCR方法(Real-time PCR)，其中，实时荧光定量PCR是在常规PCR方法的基础上建立起来的。