[发明专利]检测含有NOS终止子的转基因水稻的引物、试剂盒和方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地，本发明涉及检测转基因水稻的引物、试剂盒和方法。

背景技术

转基因生物是指利用生物技术，将外源基因转移到物种中以改造其遗传特性，从而获得人类所需的性状、营养品质而产生的生物新品种。以转基因生物或以其为原料加工而来的食品就是转基因食品。从1994年第一例转基因食品(转基因番茄)在美国诞生至今，转基因生物已广泛用于食品领域。

转基因水稻的发展状况

国内外转基因生物的研发、生产蓬勃发展，通过基因工程方式培育农作物新品种是目前作物育种的发展方向，在提高作物产量、改善品质、提高抗性等方面具有巨大潜力。

水稻（Oryza sativa L.）是我国最重要的主粮，常年播种面积约为3100万公顷，总收获量在2亿吨左右，约占我国粮食总产量的40%。1991年，Christou等用基因枪转化技术获得了转基因水稻植株。随后几年，各国将各类目的基因导入水稻获得大量转基因水稻品系。1994年，Hiei等建立了农杆菌介导的高效粳稻遗传转化技术，随后爪哇稻和籼稻的农杆菌介导转化体系也先后建立，并逐步成为水稻的主流转化技术。其它物种的抗除草剂、抗虫、抗病、抗病毒、耐盐、改善稻米品质等有益基因被引入商业水稻品种中。

中国在转基因水稻培育方面取得了重大进展，已将豇豆胰蛋白酶抑制剂基因，Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1c、Cry1Ah、Cry2a等毒蛋白基因，雪花莲凝集素基因，抗菌肽基因和来自野生稻的Xa21基因等导入多种杂交水稻恢复系中。经农业部批准，十多种转基因水稻品系正在进行环境释放、中间试验，其中有2个抗虫转基因水稻已获转基因生物安全证书。目前中国正在进行环境释放、中间试验的转基因水稻的转基因构建中都含有NOS终止子，故采用NOS终止子特异性方法可筛选检测转基因水稻及其制品。

转基因食品的管理要求

转基因食品已经得到广泛使用，但是转基因作为一种新的生物技术，其对人类健康、生态平衡的影响以及转基因食品潜在的安全性越来越成为消费者关注的焦点。

2000年联合国通过了“生物安全议定书”，该议定书对除了药物以外的所有进出境活性转基因生物有关过境、审批、检测、风险评估和管理、赔偿责任等做出了详细的规定。世界上主要国家立法对转基因产品进行管理，美加、欧盟、日本、韩国、澳新的法律明确规定，转基因生物需经政府批准，并经严格的生物安全、环境安全测试才可以田间种植、环境释放及作为食品、饲料。欧盟、日本、韩国、澳洲等要求转基因食品进行标识，并规定了相应阈值水平。我国于2001年5月23日颁布了《农业转基因生物安全管理条例》，规定对农业转基因生物实行检验检疫。2002年3月20日开始实行的《农业转基因生物标识管理办法》也规定了转基因食品的标识制度。对于执行上述联合国及各国的法规措施，转基因产品的检测是关键措施之一，需要通过定性检测确定转基因的种类，鉴别其是否为已批准的或已获准用于食品饲料，以防止具有风险的未知转基因产品的任意扩散，对社会产生危害。由于每个国家转基因标识的阈值水平都不相同，还需要通过定量检测确定转基因产品的含量，明确是否已达到所在国规定的阈值水平。

转基因食品的环介导等温扩增检测方法（LAMP）

转基因食品检测大致可分为两类。一类是核酸检测，当外源基因插入到受体细胞染色体时，一般要构建启动子、终止子、选择标记基因和报告基因，如花椰菜花叶病毒(CaMV)35s启动子，胭脂碱合酶终止子（NOS终止子）等。转基因食品核酸检测的靶标是插入的外源基因，包括外源基因的整合位点、启动子、终止子、选择标记基因和报告基因的核酸序列。目前的转基因成分检测数据库中有超过400对PCR检测引物和40多种内源参照基因。另一类是蛋白检测，即通过插入外源基因表达的蛋白质产物或其功能进行检测，已有大约20种转基因蛋白检测方法在转基因检测领域中投入使用。

核酸检测主要利用PCR方法和环介导等温扩增方法。核酸检测方法具有很高的灵敏度，在转基因领域使用最为广泛。与蛋白质具有的组织特异性相比，核酸检测技术不受材料的限制。另外，核酸比蛋白质稳定，变性之后容易复性，因此在加工食品中仍可检出。核酸检测方法的关键是引物设计，检测的特异性和灵敏度取都决于引物序列的设计。