[发明专利]一种锦鲤疱疹病毒LAMP检测试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明属于鱼类病毒检测技术领域，具体涉及一种锦鲤疱疹病毒LAMP检测试剂盒，还涉及一种利用锦鲤疱疹病毒LAMP检测试剂盒检测锦鲤疱疹病毒的方法。

背景技术

1998年5月在以色列的Magan Michael地区首次暴发锦鲤疱疹病毒病，同年成功分离出了病原锦鲤疱疹病毒（Koi herpes virus，KHV），为疱疹病毒科（Herpesviridae），鲤疱疹病毒属（Cyprinid herpesvirus）成员，又称鲤疱疹病毒Ⅲ型（CyHV-Ⅲ）。锦鲤疱疹病毒病迅速扩展至世界各地。2002年首次证实该病已传至我国，近年来给我国框镜鲤、鲤鱼的养殖业造成严重的经济损失。

目前的诊断方法有细胞培养分离技术、电镜技术、PCR、ELISA、原位杂交技术等,聚合酶链式反应(PCR)和细胞培养技术是OIE推荐的诊断方法。但是这些方法都有各自的局限性，为了及早发现和确诊锦鲤疱疹病毒病，有必要建立一种准确、快速、灵敏的检测方法，为疾病的诊断与防控提供技术手段，也为鲤鱼养殖业的健康发展提供技术保障。

环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术是Notomi等于2000年报道的一种新型等温核酸扩增方法（国际专利公开号WO00/28082），针对靶基因的6个位点设计4条LAMP引物，利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶(Bst DNA聚合酶)，在恒温条件下快速、高效、高特异、高灵敏地扩增靶序列，适合于现场和实验条件较简单的实验室进行快捷检测。引入一对环状引物的改进方法，进一步缩短了反应时间。

发明内容

本发明的一个目的是在于提供了一种锦鲤疱疹病毒LAMP检测试剂盒，根据GenBank公布的KHV毒株的TK基因编码区序列(DQ177346)，应用PrimerExplorer V4（http://primerexplore r.jp/elamp4.0.0/index.html）在线软件设计特异性引物，利用LAMP技术扩增靶基因的特定区域，从分子水平对锦鲤疱疹病毒进行快速检测，具有简便、快速、高特异性和灵敏性的特点。

本发明的另一个目的是在于提供了一种利用锦鲤疱疹病毒LAMP检测试剂盒检测锦鲤疱疹病毒的方法，本方法仅需一个水浴锅或金属浴即可在2小时内准确检测出样品中的KHV，能检测KHV感染的病鱼组织，能检测KHV感染的细胞（例如Koi-Fin细胞），非常适用于KHV的现场快速检测。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种锦鲤疱疹病毒LAMP检测试剂盒，包括以下成分：

该试剂盒包括以下成分：10×ThermoPol Reaction Buffer；Bst DNA聚合酶（NEB）；dNTPs；外引物F3和B3、内引物FIP和BIP、Betaine（Sigma），MgCl₂，1000×SYBR Green I（Invitrogen）。

F3：5'-GCATCGCCGTCAAGCAC-3'；

B3：5'-GCAGCTGCACGACTCC-3'；

FIP：5'-AGATGGCCGGGTAGGTCGCTTTTGCCATAGACCAGCGCTACA-3'；

BIP：5'-ACCTGTACGAGGTGATGCAGCTTTTAGGTCGGGGAAGAACTGTC-3'。

一种利用锦鲤疱疹病毒LAMP检测试剂盒检测锦鲤疱疹病毒的方法，其步骤是：

1、病毒DNA的获取：

采用试剂或Viral DNA Kit试剂盒等提取样本总DNA，模板DNA在95℃5分钟后迅速置于冰浴中的预处理可以增加检测的灵敏度。

2、LAMP扩增：

采用25μl反应体系，包括：内引物FIP和BIP各0.8μM，外引物F3和B3各0.1μM，dNTPs1mM，Betaine0.5M，MgCl₂2-10mM，Bst DNA聚合酶8U，模板DNA5μl，10×ThermoPol Reaction Buffer2.5μl，去离子水补足余量。选择55-65℃的温度范围和30-120分钟的时间范围进行LAMP反应之后，80℃灭活2分钟。

3、检测结果判定，可用下述三种方法之一进行结果的判定：

1）发生扩增反应时，从dNTPs析出的焦磷酸根离子和反应液中的镁离子形成白色焦磷酸镁沉淀，通过肉眼判断：检测管出现明显浑浊为阳性，未见浑浊为阴性。