[发明专利]荧光素内酰胺一氧化氮荧光探针的制备和应用

说明书

技术领域

本发明涉及微量一氧化氮的测定技术领域，具体地说是一种基于荧光素内酰胺衍生物的一氧化氮分子荧光探针的制备和应用。 

背景技术

一氧化氮(NO)作为一种重要的生物信息分子，在生命过程中发挥着重要的生理作用。目前，NO被认为是生命必需的调节分子，它在心血管系统，中枢和外周神经系统及免疫系统中起关键的作用。而且NO是植物体中普遍存在的关键信号分子，参与植物的生长、发育和抗病防御等多种生理过程。要研究阐明NO的生理功能和病理机制，就必需快速灵敏检测体内或体外产生的NO的浓度及其时空分布。因此建立高灵敏度、高选择性检测组织和细胞内NO的分析方法具有重要意义(文献1：Koshland D E.The Molecule ofthe Year，Science，1992，258：1861-1861；文献2：张灯青，赵圣印，刘海雄，一氧化氮荧光分子探针，化学进展，2008，20(9)：1396-1405；文献3：张丽丽，周杰，植物体中一氧化氮的检测方法及其应用，植物生理学通讯，2007，43(5)：921-927)。目前NO的检测方法主要有荧光法、电化学法、化学发光法、电子自旋共振波谱法和紫外-可见光谱法等，其中荧光法灵敏度高、选择性好、操作简单的特点，荧光检测若和显微镜连用能够实现对细胞内和细胞外NO的成像，达到高的时空分辨率，因此是目前最为理想的检测方法之一(文献2；文献4：张娴，王红，梁淑彩，张华山，检测生理内源性一氧化氮分子探针的研究及应用进展，分析科学学报，2002，18(6)：513-517)。基于荧光法的NO荧光分子探针主要有两种机理，一种是基于过渡金属的NO传感器，另一种是基于光诱导电子转移(PET)机理的NO传感器(文献5：Gunnlaugsson T，Ali H D P，GlynnMetal Fluoreseent Photoindueed eleetrontransfer(PET)sensors for anions：From design to Potential applieation，Joumal of Fluoreseenee，2005，15(3)：287-299)。但这类荧光探针的主要缺点是：探针合成过程复杂、产率低；探针本身的空白信号会降低NO检测的灵敏度，或者干扰成像；探针对目标分子缺乏明显的发色行为。因此，在选择性、灵敏性及基于新的发光机理等方面还需要改进和发展。Zheng Hong和XU Jin-Gou等人报道了一种基于罗丹明螺旋内酰胺的NO分子荧光探针，它是通过NO与罗丹明B螺旋内酰胺进行开环反应，所生成的产物再水解成有荧光的罗丹明B，从而实现对NO的探测，该探针合成方法简单，本身无荧光，有利于提高NO检测的灵敏度和生物成像(文献6：H.Zheng，G.Q.Shang，S.Y.Yang，X.Gao，J.G.Xu.Fluorogenic and chromogenic rhodamine spirolactam based probe for nitric oxide by spiro ring opening reaction，Organic Letters，2008，10(12)：2357-2360)。 

本发明合成了二氯代或二氟代荧光素，然后与邻苯二胺反应制备荧光素内酰胺衍生物，用作一氧化氮分子荧光探针，检测体外微量一氧化氮，并用于大鼠巨噬细胞中一氧化氮的检测。 

发明内容

本发明的目的是提供一种基于荧光素内酰胺衍生物的一氧化氮分子荧光探针的制备和应用。所发明荧光素内酰胺衍生物结构如下式所示： 其中：X＝Cl，F 

制备方法的主要步骤如下： 

(1)以氯化锌为催化剂，由4-氯(或氟)间苯二酚与邻苯二甲酸酐熔融反应生成二氯(或二氟)代荧光素； 

(2)二氯(或二氟)代荧光素与二氯亚砜反应生成二氯(或二氟)代荧光素酰基氯； 

(3)以DCC/DMAP(N，N′-二坏己基碳二亚胺/4-二甲氨基吡啶)为催化剂，二氯(或二氟)代荧光素酰基氯与邻苯二胺在乙腈中反应生成荧光素内酰胺衍生物，粗产物用柱层析法分离提纯。 

本发明的荧光探针有如下优点： 

1.合成方法简单，产率高，易提纯，原料易得，成本低，产品稳定易保存； 

2.探针本身无荧光，背景干扰小，灵敏度高，适用pH范围宽且荧光稳定，可适用于生理pH范围内NO的检测； 

3.对NO的选择性高，与其它活性氧物作用时儿乎不产生荧光信号；