[发明专利]猪支原体肺炎PCR诊断试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种试剂盒，尤其是一种猪支原体肺炎PCR诊断试剂盒。

背景技术

猪支原体肺炎（Mycoplasma hyopneumoniae of swine，MPS）又称猪喘气病，是由猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp） 引起猪的一种高发病率、低死亡率的慢性呼吸道传染病（Straw B E等，1999）。该病在世界上广泛流行和存在，其典型症状是病猪咳嗽、呼吸困难和气喘，主要病变特征是融合性支气管肺炎，在肺的尖叶、心叶、中间叶和膈叶前缘呈“肉样”或“虾肉样”实变。本病仅发生于猪，不同品种、年龄和性别的猪均能感染，其中以哺乳猪和幼猪最易感，发病率和死亡率较高。支原体感染后会出现免疫抑制，且容易继发感染其他传染病，因而对养猪业造成较为严重的经济损失（杨建德等，2002）。Mhp的检测通常是基于病原的分离或免疫荧光实验。近几年，对于Mhp的分离，血清学鉴定和血清抗体监测已发展了许多方法，这些方法尽管在理论上可以广泛应用，但仅有少数条件好的实验室才能做到，因此，一些非特异性方法仍然是有用的。

发明内容

本发明的目的是：提供一种猪支原体肺炎PCR诊断试剂盒，它能快速的检测出猪肺炎支原体，并且具有特异、灵敏、准确的特点，为猪支原体肺炎的防制提供科学依据。

本发明是这样实现的：猪支原体肺炎PCR诊断试剂盒, 它包括浓度为0.1moL/L的PBS40uL，裂解液250uL，DL2000100uL，PCR酶250uL，超纯水170uL，引物40uL，阳性对照20uL及阴性对照20uL；其中引物包括上游引物及下游引物，上游引物及下游引物各20 uL，上游引物的序列为5’- TAGACCAGGATGGACAAGATGAT -3’，下游引物的序列为5’- AACCACAGGACTAAGACGCAACA -3’。

阴性对照为超纯水，共计20 uL。

阳性对照为重组pMD18-T-ompA质粒，共计20uL。

缓冲液为50mM的Tris-HcL及150mM的NaCL的混合溶液, 共计40uL。

PCR酶的组成包括10mM的Tris-HcL、50mM的KCL、1.5mM的MgCL₂以及0.05U的Poymerase/Ul,共计250uL。

裂解液由Tris-HcL50mM、EDTA2mM、NaCl100mM以及占裂解液总体积5%的SDS组成的混合溶液，250uL。

为了验证本发明的效果进行了如下实验：

1 材料与方法

1.1 菌株猪肺炎支原体标准株P216购自中国兽医微生物保藏管理中心，猪肺炎支原体活疫苗168株购自南京天邦生物科技有限公司；猪胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜杆菌、鸡毒支原体、大肠杆菌、鸡肠炎沙门氏菌由贵州省畜禽疫病研究实验室保存。

主要试剂Goldview、Tris、EDTA、DL2000、Taq DNA Polymerase（5U/μL）及相应10×Taq Buffer、dNTP等购自宝生物（大连）工程有限公司；苯酚、氯仿、无水乙醇、支原体培养基为国产试剂。

引物设计根据猪肺炎支原体ompA基因序列设计1对特异性引物，由宝生物（大连）工程有限公司合成，上游引物:5’-TAGACCAGGATGGACAAGATGAT-3’，下游引物：5’-AACCACAGGACTAAGACGCAACA-3’。

试剂盒组成

(1)0.1moL/L PBS ；(2）裂解液；(3) DL2000；(4) PCR酶；(5) 超纯水；(6) 引物；(7) 阳性对照；(8)阴性对照

1.5 猪肺炎支原体核酸的抽提

(1) 取待检样品肺、淋巴结、扁桃体等组织样品共约50 mg，加入500 μL PBS缓冲液，待检样品研磨后－20℃反复冻融3次12000 r/min离心取上清用于核酸的提取，用酚氯仿法提取猪肺炎支原体 DNA。

(2) 猪肺炎支原体标准株、猪肺炎支原体活疫苗168株、大肠杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜杆菌、鸡毒支原体、鸡肠炎沙门氏菌纯菌液，鼻拭子样品均用煮沸法提取DNA。

反应条件的优化