[发明专利]一种抗AChE干扰且能快速检测BChE活性的方法

说明书

【技术领域】

本发明属于酶活性检测技术，特别是一种抗AChE（乙酰胆碱酯酶）干扰且能快速检测BChE（丁酰胆碱酯酶）活性的方法。

【背景技术】

近年来，由于胆碱酯酶在人体内神经递质传感中的重要性，以及在阿尔兹海默症治疗中的关键作用受到广泛关注，参见：Lane,R.M.;Potkin,S.G.;Enz,A.Int.J.Neuropsychopharmacol.2006,9,101–124。目前，基于胆碱酯酶活性的检测和相应的抑制剂的筛选已经成为研究热点，参见：1)Pardo-Yissar,V.;Katz,E.;Wasserman,J.;Willner,I.J.Am.Chem.Soc.2003,125,622-623；2)Maeda,H.;Mastuno,H.;Ushida,M.;Katayama,K.;Saeki,K.;Itoh,N.Angew.Chem.,Int.Ed.2005,44,2922–2925；3)Bailey，D.M.;Hennig,A.;Uzunova,V.D.;Nau,W.M.Chem.Eur.J.2008,14,6069–6077；4)Nau,W.M.;Ghale,G.;Hennig,A.;Bakirci,H.;Bailey，D.M.J.Am.Chem.Soc.2009,131,11558–11570；5)Ghale,G.;Ramalingam,V.;Urbach,A.R.;Nau,W.M.J.Am.Chem.Soc.2011,133,7528–7535；6)Dsouza,R.N.;Hennig,A.;Nau,W.M.Chem.Eur.J.2012,18,3444–3459。

脊柱动物体内普遍存在两种重要胆碱酯酶，乙酰胆碱酯酶（AChE）和丁酰胆碱酯酶（BChE），相似度>65%，参见：Massouliè,J.;Sussman,J.;Bon,S.;Silman,I.Brain Res.1993,98,139146。研究证明，BChE在人体内具有清除体内抗胆碱物质，将药物前体转化为活性组分等重要的作用，参见：Cokugras,A.N.Turk.J.Biochem.2003,28,54–61。并且，在阿尔兹海默症患者的体内，AChE的活性降低，BChE活性升高，使得BChE可以作为该疾病诊断和治疗的目标，参见：Lane,R.M.;Potkin,S.G.;Enz,A.Int.J.Neuropsychopharmacol.2006,9,101–124。但是，现有的多数检测胆碱酯酶活性的方法都是针对AChE活性的检测，目前还没有一种能够快速直接选择性检测BChE的方法。所以，建立一种抗AChE干扰，并且能够灵敏、快速、实时、专一检测BChE活性的方法具有重大的意义和广阔的应用前景。

超分子串联检测是一种新颖的酶活性测定方法，主要利用大环主体化合物与荧光染料、酶底物、相应产物三者键合强弱的差异得到荧光检测信号，再应用到酶反应过程中，达到通过检测荧光信号检测酶活性的目的，参见：Dsouza,R.N.;Hennig,A.;Nau,W.M.Chem.Eur.J.2012,18,3444–3459。同时，荧光光谱检测技术具有经济、易于操作、直观且快速得到响应信号等优势。

【发明内容】

本发明的目的是针对上述技术分析，提供一种抗AChE（乙酰胆碱酯酶）干扰且能快速检测BChE（丁酰胆碱酯酶）活性的方法，该检测方法工艺简单、便于操作、无需标记、灵敏快速、直观持续、具有良好的生物相容性，能够在过量的AChE存在下，高选择的检测BChE的活性，即时快速的给出明显的荧光检测信号。

本发明的技术方案：

一种抗AChE（乙酰胆碱酯酶）干扰且能快速检测BChE（丁酰胆碱酯酶）活性的方法，以磺化杯[4]芳烃（SC4A）和染料光泽精(LCG)作为酶活性检测的传感对，以琥珀酰胆碱(SuCh)作为酶反应底物，建立了用于BChE活性监测的超分子串联检测体系，步骤如下：

1）在37°C温度下，用10mmol/L pH8.0的磷酸缓冲溶液配置含有0.5μmol/LSC4A、0.5μmol/L LCG和10μmol/L SuCh的溶液，得到用于BChE活性监测的超分子串联检测体系；

2）在上述体系中加入1U/ml的BChE，即可在15min内得到明显的荧光淬灭信号。

本发明的工作原理：