[发明专利]一种可简易检测自然水样中多种赤潮藻的试剂盒

权利要求书

1.一种可简易检测自然水样中多种赤潮藻的试剂盒，其特征在于，包括膜分类基因芯片条，含检测赤潮异湾藻、东海原甲藻、新月菱形藻、共生甲藻、中肋骨条藻、柔弱角毛藻、三叶原甲藻、塔玛亚历山大藻共8种赤潮藻的种特异性探针、阴性对照探针和阳性对照探针，每条探针2个重复；

核酸制备所需试剂：

自然样品核酸粗提试剂：2%(m/v)CTAB,0.5%(v/v)β-mercaptoethanol,1.4M NaCl,20mM EDTA,100mM Tris-Cl,10U RNase Inhibitor；

5×NASBA Buffer：0.2M Tris-HCl,60mM MgCl2,0.35M KCl2,25mM DTT,20mM dNTP；

NTP：10mM ATP,10mM GTP,10mM CTP，6.5mM UTP,3.5mMDigoxigenin-11-UTP；

5×Primer mix：75%DMSO,1μM NASBA-P1,1μM NASBA-P2,25mM DTT,20mM dNTP；

4×Enzyme mix：1.5M山梨醇,0.42mg/ml BSA,16U/ml RNase H,6400U/ml T7RNA Polymerase,1280U/ml RT-M-MLV，4000U/ml RNA inhibitor；

核酸杂交所需试剂：

RNA变性剂：1.5M NaCl，0.15M二水柠檬酸三钠，pH7.0,0.15M甲醛；

杂交液：1%Blocking Reagent II，0.75M NaCl,0.075M二水柠檬酸三钠，50μg/ml鲑精DNA；

Buffer II：1%Blocking Reagent II,0.1M Tris,0.15NaCl,pH7.5；

碱性磷酸酶标记的DIG抗体：AP-抗DIG；

20×SSC：3M NaCl，0.3M二水柠檬酸三钠，pH7.0；

10×Buffer I：1.0M Tris,1.5M NaCl,pH7.5；

10×Buffer III：1.0M Tris,1.0M NaCl,0.5M MgCl₂,pH9.5；

10%SDS；

显色剂：2.81%NBT，2.19%BCIP，70%二甲基甲酰胺。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述膜分类基因芯片条的制备方法为：

（1）按下表序列信息：

探针信息

（2）将合成的探针干粉溶解于0.1M Tris-HCl(pH7.5)，配制成浓度为10μM的溶液；

（3）隔着衬纸在尼龙膜上用软铅笔划格,每格大小为5×5mm²,其总大小为0.25cm²，沿总框线将所用的尼龙膜剪下，在尼龙膜第一格的左上角用软铅笔点上点标记；

（4）将尼龙膜飘浮于双蒸水表面,让其吸水后沉入水中，再捞出浸泡于20×SSC中5min，再将膜放置于滤纸上晾干；

（5）探针点膜及固定：将配制的探针溶液用毛细吸管或移液器在上述处理过的尼龙膜上点样0.5~1μl，自然晾干；将点样后的尼龙膜夹于两层滤纸中间，在80°C烘箱内处理2h。