[发明专利]一种基于Fe3O4纳米材料的食源性致病菌NMR检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种致病菌NMR检测方法，尤其涉及一种基于Fe₃O₄纳米材料的食源性致病菌NMR检测方法。 

背景技术

基本原理：将单克隆抗体或抗原分子与酶分子通过共价键结合，这种结合不会改变单克隆抗体、抗原和酶的免疫学特性及生物活性，特异性的单克隆抗体只会与特异性的抗原结合。其主要的原理步骤1. 利用Fe₃O₄磁珠，包被一层高分子化合物，经过改性后采用适当的偶联剂将待检目标菌的单克隆抗体偶联在磁珠表面，形成特异性免疫磁珠。2. 将另一部分目标菌的特异性单克隆抗体采用一定的方法固定在固相载体表面，并将多余活性位点封闭。3. 将制备的特异性免疫磁珠用于抓取富集目标菌，通过外加磁场将磁珠分离出来，此时，结合了目标菌的磁珠和没有结合目标菌的磁珠还是混在一起。4. 将上述混在一起的磁珠，加到第2步的固相载体表面，则抓取了目标菌的磁珠将与固相载体表面单克隆抗体发生特异性结合，形成双抗夹心，用无菌的去离子水清洗可以将未发生结合的磁珠洗脱。5. 再采用洗脱剂将固定载体上的结合的特异性纳米免疫磁珠洗下来，清洗掉离子，溶剂。此部分磁珠如果存在，就是抓取了目标菌的磁珠。由于Fe₃O₄具有顺磁和超顺磁特性，对于共振仪器非常敏感，相对于其他分子而言，微量的Fe₃O₄能够大幅降低无菌的去离子水的自旋-晶格驰豫参数T1和自旋-自旋弛豫时间T2，而无菌的去离子水在一定的均匀场强下，T1/T2是固定的。将洗脱液置于核磁共振仪中，与无菌的去离子水对照组进行对照。显著发生T2/T1值降低的说明有磁珠存在，从而间接说明食品样品中有致病菌检出。磁珠含量与T2/T1值降低呈正比。通过加标，可以定量检测目标菌。该方法中Fe_３O_４磁珠既是分离富集的手段，同时它具有的顺磁和超顺磁特性，又可作为定量检测的探针。该方法的主要优点就是快速、灵敏度高。相对于致病菌的微生物培养2-3天甚至几天的时间。此方法主要取决于样品的预处理时间，核磁共振检测只需几分钟。因此，用该方法可做大规模待检样本的阳性筛选，检出的阳性样还需用微生物培养进行确证。目前， 国内外还没有文献报道这种方法，但是采用免疫磁珠进行致病菌的富集，目标物的富集等的报道还是很多的，但都没有采用核磁共振做进一步的检测。 

发明内容

本发明的目的是提供一种基于Fe₃O₄的NMR纳米探针的核磁共振技术快速检测出食品中的有害致病菌的方法，用于对各种不同的食品样品进行评价，该方法是一种客观有效的检出食品中有害致病菌的方法，从而在某种程度上大大缩减了食品样品有害致病菌的筛选时间。 

一种基于Fe₃O₄的NMR纳米探针的核磁共振技术快速检测出食品中的有害致病菌的方法，核磁共振仪对顺磁、超顺磁物质的响应敏感性，提出核磁共振弛豫参数变化与Fe₃O₄纳米超顺磁免疫磁珠含量的相关性指标。不同的致病菌检出下限不同。 

该方法依赖于建立的可用于食品样品中有害致病菌特征性免疫磁珠富集、分离，从核磁共振弛豫信号参数变化的角度，检测出样品中的有害致病菌。采用偶联了特异性单克隆抗体的超顺磁免疫磁珠，可以将样品中的特异性致病菌进行富集。由于核磁共振仪自旋-晶格弛豫效率和自旋-自旋弛豫效率对Fe₃O₄纳米粒子非常敏感，即在去离子水中，存在微量的超顺磁Fe₃O₄纳米粒子，则水的自旋-晶格弛豫时间（T1）和/自旋-自旋弛豫（T2）就会显著下降。在一定条件下，超顺磁免疫磁珠的顺磁特性使核磁共振的弛豫衰减信号T2/T1产生线性减小。通过定量检测出样品中的免疫磁珠含量，从而可以间接定量出食品样品中的有害致病菌含量。检测出的致病菌含量与磁珠含量线性相关，相关系数R²为0.98，拟合度较好。最终以超顺磁免疫磁珠与致病菌间的对应关系为纽带，确定食品样本中的致病菌菌落数。 

本发明是这样实现的，步骤如下： 

1）检测目标菌的特异性免疫磁珠的制备；

2）将目标菌特异性单克隆抗体固定在固相载体表面；