[发明专利]一种脂肪细胞中自噬的监测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种脂肪细胞中自噬的监测方法。

背景技术

1962年，Ashford和Porten发现自噬现象。通过定向敲除自噬必需的基因，发现自噬作用在多方面发挥重要作用，如肿瘤抑制，神经保护，红细胞分化,另有报道，自噬涉及到生长发育、衰老、组织稳态的控制。神经变性、肿瘤、Huntington病、Parkinson病、肌病和心肌病等都涉及到自噬调节紊乱，自噬还诱导2型程序性死亡。

随着近十年来自噬领域研究的“爆炸式”的发展，吸引着不同专业背景的科学家从各个角度进入这一领域。最近研究发现，自噬在调节脂质代谢和脂肪细胞的分化方面发挥重要作用。自噬在脂肪细胞功能中的作用研究虽然刚刚起步，目前代表性的文献只有2-3篇，但已经显示出巨大的研究前景。同时，对成熟的脂肪细胞上自噬的调控机制的研究目前几乎空白。

因此，在脂肪细胞中建立一套成熟的监测自噬的技术方法就具有重要意义。成熟脂肪细胞由于其特殊的结构，胞内充满大量脂滴，使细胞器和核向周边移位，电镜下难以看到典型的自噬体。但我们经过多次实验，不断改进实验条件，终于成功的在成熟的3T3-L1脂肪细胞内观察到处于各个自噬阶段的自噬结构。此外，由于成熟脂肪脂肪具有不易转染的特点，普通的质粒转染很难达到预期的效果。因此，我们利用GFP-LC3慢病毒方法感染3T3-L1脂肪细胞，荧光显微镜下观察感染效率达到80%以上。在营养饥饿情况下，我们成功观察到GFP-LC3点状聚集现象。成熟脂肪细胞内自噬监测方法的建立为我们以后研究自噬与脂代谢的关系奠定了基础。

发明内容

本发明的目的在于在脂肪细胞中建立一套监测自噬的技术方法。

本发明的技术方案如下：

一种脂肪细胞中自噬的监测方法，包括以下步骤：

（1）培养及诱导分化3T3-L1前脂肪细胞获得成熟的脂肪细胞，用0.2%BSA-DMEM孵育12h，裂解所获得的脂肪细胞，抽提其蛋白质；

（2）采用BCA法对蛋白质进行定量，计算所获得的蛋白质样品的浓度，然后进行蛋白免疫印迹分析；

（3）以小鼠的肝脏cDNA为模板，根据Genebank的小鼠LC3b基因编码区设计引物，根据载体质粒上的多克隆位点选择LC3编码区不含有的酶切位点加入到引物的上下游，上游引物的序列为：CCGCTCGAGATGCCGTCCGAGAAGACC，酶切位点为XhoⅠ；下游引物的序列为CGCGGATCCCCCTGTCGTTACCGACACATT，酶切位点为BamHⅠ；PCR产物割胶回收，扩增出LC3b DNA片段，取双酶切后的的LC3片段和的pLVX-IRES-ZsGreen1进行T4DNA连接酶连接，培养产物，提取质粒，取酶切验证后的质粒进行测序分析；

（4）用PlVX-LC3-IRES-ZsGreen1质粒，delta8.9质粒和VSVG转染293T细胞，收集病毒上清，进行慢病毒滴度的测定；

（5）病毒转染成熟3T3-L1脂肪细胞，共聚焦显微镜观察及电镜观察自噬体。

成熟脂肪细胞由于其特殊的结构，胞内充满大量脂滴，使细胞器和核向周边移位，电镜下难以看到典型的自噬体。但本发明经过多次实验，不断改进实验条件，终于成功的在成熟的3T3-L1脂肪细胞内观察到处于各个自噬阶段的自噬结构。此外，由于成熟脂肪具有不易转染的特点，普通的质粒转染很难达到预期的效果。因此，本发明利用GFP-LC3慢病毒方法感染3T3-L1脂肪细胞，荧光显微镜下观察感染效率达到80%以上。在营养饥饿情况下，本发明成功观察到GFP-LC3点状聚集现象。成熟脂肪细胞内自噬监测方法的建立为我们以后研究自噬与脂代谢的关系奠定了基础。

具体实施方式

实施例：

3T3-L1前脂肪细胞株的培养与传代