[发明专利]一种新的亚油酸异构酶基因及包含该基因的载体和菌株

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及基因的优化及构建，尤其是一种新的亚油酸异构酶基因及包含该基因的载体和菌株。 

背景技术

共轭亚油酸（Conjugated linoleic acid，简称CLA）是具有共轭双键的十八碳二烯酸，是人体必需脂肪酸亚油酸（linoleic acid，简称LA）衍生而成的一系列位置和构象异构体的总称。CLA具有抗癌、抗动脉粥样硬化、降低胆固醇、调节血糖、增强机体免疫能力、促进生长等多种生理活性。其中，t10,c12-CLA是最具生理活性的异构体之一。在自然界中，CLA广泛存在于反刍动物的肉制品和乳制品中，但是含量极低。 

目前，工业上生产CLA主要采用化学异构法，即通过亚油酸的碱催化异构化。但是，这种方法获得的产物是多种异构体的混合物，除了具有生理活性的异构体外，还有多种安全性未知的副产物的存在，而活性异构体的分离纯化是十分困难的。采用生物技术，获得能够表达亚油酸异构酶的菌株，利用自身的亚油酸异构酶将LA转化成CLA，条件温和，并且能够合成具有生理活性的单一异构体，可以大大节省后续分离纯化的步骤，降低生产成本。来源于痤疮丙酸杆菌（Propionibacterium acnes）的亚油酸异构酶（PAI）是唯一一种已知晶体结构的亚油酸异构酶，能够将LA转化为单一活性异构体t10,c12-CLA，并已在大肠杆菌、酵母、烟草及大米等多种系统中成功的进行了表达。 

尽管PAI已在多种系统中进行了表达条件的摸索，但是CLA的产量比较低，主要是由于在表达异源基因的过程中，绝大多数生物倾向于利用这些密码子中的一部分，几乎每种生物都表现出某种程度的对密码子利用的偏爱。例如，在酵母中，编码丰度高的蛋白质的基因明显避免低使用率的密码子。因此，本发明首先根据酿酒酵母基因组数据，分析酿酒酵母的密码子偏爱性，对pai进行密码子优化，采用偏爱密码子并避免利用率低的或稀有的密码子来合成基因，可以在一定程度上减弱由于密码子利用而产生的影响，提高CLA的产量。 

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种新的亚油酸异构酶基因及包含该基因的载体和菌株，本发明将密码子优化后的copai基因的编码蛋白coPAI在酿酒酵母表面展示表达，同时利用该菌株将LA转化为具有生理活性的单一异 构体t10.c12-CLA，其转化产物纯度高，易分离。 

本发明实现目的的技术方案如下： 

一种亚油酸异构酶基因，所述基因序列见序列3。 

一种含有亚油酸异构酶基因的载体，含有如序列3所述的亚油酸异构酶基因。 

而且，所述载体的质粒片段来源于质粒pYD1。 

一种含有亚油酸异构酶基因的工程菌，含有如序列3所述的亚油酸异构酶基因。 

而且，所述工程菌的质粒载体为pYD1。 

而且，所述工程菌的宿主菌为酿酒酵母EBY100。 

一种基因工程菌表达亚油酸异构酶的方法为，接种到YNB-CAA中，经半乳糖诱导培养，离心，收集菌体；所述的半乳糖浓度为1-2%g/L；所述的诱导温度为20-25°C；所述的诱导时间为48-96h。 

一种基因工程菌发酵共轭亚油酸的方法，将所述工程菌加入到含有亚油酸的缓冲液中pH6.5-7.5，振荡反应；所述的缓冲液为磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲液；所述的反应温度为30-37°C；所述的反应时间为4-36h。 

一种产共轭亚油酸的全细胞催化剂，所述全细胞催化剂含有亚油酸异构酶基因的工程菌，所述共轭亚油酸为t10,c12-CLA。 

本发明的优点和积极效果如下： 

1、本发明首先对来源于痤疮丙酸杆菌（Propionibacterium acnes）的亚油酸异构酶（pai）进行了密码子优化，得到基因copai，在一定程度上避免了由于密码子偏爱性对蛋白的表达产生的影响，将copai插入载体pYD1中，构建了表达载体pYD1::copai，并将它导入酿酒酵母EBY100中，获得含有表达载体pYD1::copai的酿酒酵母菌株EBY100-pYD1-copai。上述菌株经诱导培养后，coPAI成功的展示在酿酒酵母细胞壁表面，能够与底物亚油酸充分接触，并将LA专一的转化为t10,c12-CLA。 

2、本发明首先根据酿酒酵母基因组数据，分析酿酒酵母的密码子偏爱性，对pai进行密码子优化，采用偏爱密码子并避免利用率低的或稀有的密码子来合成基因，可以在一定程度上减弱由于密码子利用而产生的影响，提高CLA的产量。