[发明专利]一种鉴定七种海参种类的PCR-RFLP方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种分子生物学中鉴定海参种类的方法，特别是涉及一种鉴定七种海参品种的PCR-RFLP方法。

背景技术

海参是我国传统的海洋食物和药物资源。由于不同种类海参的营养价值、经济价值存在较大差异，一些不法商贩常用以假乱真、以次充好等手段欺骗消费者。失去原有形态的海参更易出现造假现象。

传统的海参种类鉴定方法为形态学鉴定，主要依据海参的外部形态和解剖特征：外部特征包括触手的形状、疣足和管足的有无、形状及其分布特征等；解剖特征主要指海参骨片的形态和呼吸树的有无。但是，形态学鉴定有其局限性：1）表型可塑性和遗传可变性容易导致不正确的鉴定；2）形态学方法无法鉴定许多群体中普遍存在的隐存分类单元；3）形态学鉴定受生物性别和发育阶段的限制，影响鉴定的准确性；4）工作量大，耗时长。

DNA条形码技术指在生物分类学领域中用动植物的基因序列作为鉴别不同物种的“条形码”，即利用标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段在物种种内的特异性和种间的多样性创建的一种新的生物身份识别系统，它可以对物种进行快速的自动鉴定。COⅠ基因是位于线粒体DNA上的一段编码细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ的基因，长度约为692bp。2003年，Hebert根据线粒体基因的进化速率、突变特点将COⅠ基因作为条形码对动物界中共11个门的物种进行了分析，证明了COⅠ基因作为DNA条形码的可行性。线粒体COⅠ基因具有分子结构简单、严格的母系遗传、无重组、易扩增、进化速率快、多拷贝等优点，目前已经作为主要的DNA条形码广泛应用于动物的种类鉴定。已有研究将COI基因用于海参种类鉴定。Allan等人利用COI基因绘制系统进化树方法，实现海参种类的鉴定。本实验室前期研究，对COI基因进行测序，与美国国立生物技术信息中心（NCBI）中COI基因数据库比对，实现了海参种类的鉴定。但是这两种方法需经测序，并与网上数据比对，绘制进化树才能得出结论，耗时长、成本高、通量低。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种鉴定七种海参种类的PCR-RFLP方法，能克服现有技术的缺点，实现海参种类的快速鉴定，同时可对失去外部形态特征的海参酶解液进行鉴定。PCR-RFLP方法不需要测序，因此省去了PCR产物纯化、测序时间，并节约了成本，在保证可靠性的情况下，该方法更简便、快捷。

本发明的基本原理为：用PCR扩增目的DNA，扩增产物再用特异性内切酶消化切割成不同大小片段，直接在凝胶电泳上分辨。不同等位基因的限制性酶切位点分布不同，产生不同长度的DNA片段条带。此项技术大大提高了目的DNA的含量和相对特异性，而且方法简便，分型时间短。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种鉴定七种海参种类的PCR-RFLP方法，它的步骤为首先提取海参DNA模板；然后对COⅠ基因的特异性片段进行PCR扩增得到690bp左右的片段；其次对扩增产物用限制性内切酶酶切；最后对酶切产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，不同海参的酶切产物聚丙烯酰胺凝胶电泳后得到不同数量和大小的条带；

所述的PCR扩增的引物：COⅠef5’-ATAATGATAGGAGG[A/G]TTTGG-3’，COⅠer5’-GCTCGTGT[A/G]TCTAC[A/G]TCCAT-3’；

所述的七种海参分别为加州拟刺参、北大西洋瓜参、仿刺参、梅花参、海地瓜、美国肉参和靴参；

所述的限制性内切酶是SSPⅠ、EcoRⅤ、ScaⅠ和PvuⅡ中的一种、两种、三种或全部四种。

进一步，所述的PCR扩增反应体系为50μL，包含25mM MgCl₂2μL，10mM dNTP1μL，两条引物各1μL，反应体系中每种引物终浓度0.2μM，Taq DNA聚合酶5U，10×PCR Buffer5μL以及模板DNA200ng,余量用水补齐；

进一步，所述的PCR扩增反应参数为：94℃预变性5min后经过30个循环，每个循环包括94℃50sec，46℃1min，72℃1min，最后72℃延伸10min。进一步，所述的限制性内切酶酶切反应体系为30μL，包括：10×酶切缓冲液2μL，PCR产物10μL，单一酶浓度1FDU/μL0.5μL或多种酶每种浓度1FDU/μL各0.5μL，其余用水补齐，反应时间为37℃30min。

本发明与现有技术相比的有益效果：