[发明专利]一个抑制BMPR-lB基因表达合成的shRNA分子

说明书

技术领域

本发明是“七个抑制BMPR-1B基因表达合成的shRNA分子”的专利， 即申请号为2011103725220的母案专利的分案申请。

本发明涉及能够对骨形成蛋白受体-1B(BMPR-1B)基因产生显著抑制作用的小干扰RNA分子的设计、合成和抑制作用在Hek293细胞上的评价方法。

背景技术

BMPR-IB基因是一种增加排卵率的调控基因，属于TGF-?超家族成员，又称为ALK6基因；ALK6 突变是在Booroola母羊(FecB)中发现的第一个点突变，发生在高度保守的胞内激酶区，核苷酸830处（A830G），引起精氨酸代替了谷氨酰胺(Q249R)；其显性表现型为卵泡发育提前以及产多胎。文献检索披露：(1)Biol.Reprod.64,1225-1235作者：Wilson,T.等发表《表现为多胎性状的Booroola羊，在卵母细胞和颗粒细胞表达的ALK6基因的一个突变》文章内容是携带Fec^B纯合子的母羊其排卵率升高，伴随着大量囊状卵泡比Fec^B+杂合子的母羊提前成熟并发生排卵；因此，携带Fec^B纯合子母羊其排卵前卵泡提前达到了最大直径并维持在一定水平，直到排卵，导致最终卵泡生长动力学发生了变化。(2)ReproductiveBiologyandEndocrinology2006,4:20doi:1184/1477-7827-4-20作者Stéphane Fabre等发表《在哺乳动物中调节排卵率：羊基因模型的作用》文章，内容是BMP15,GDF9,BMPR-IB这三个基因型来理解BMP系统的作用作为卵巢内滤泡生长和成熟的调节最后影响排卵率。(3)Reproduction (2011) 141 643-651作者Wei Wang等发表《RNA分子干扰猪的含有内源性SMAD4的颗粒细胞导致的FSH介导的颗粒细胞的增值和类固醇合成的减少》文章内容是在猪的颗粒细胞上用RNA干扰的方法敲低了SMAD4，结果显示了SMAD4-siRNA抑制了SMAD4的mRNA和蛋白的表达并抑制了FSH引起的猪颗粒细胞的分化和雌二醇的分泌和细胞周期蛋白的表达。

关于BMPR-IB基因shRNA分子的研究，ALK6 基因干扰的小鼠并没有像Booroola母羊一样表现出多胎性状，且卵泡发育和排卵率都表现正常，但其软骨形成受到影响，骨骼肌发育存在缺陷,说明ALK6 突变存在种属差异,针对其它家畜品种，如绵羊、山羊、猪等，均未见报道。

本发明构思根据绵羊BMPR-lB基因cDNA序列，自行设计合成的shRNA分子，通过功能验证，得到1个对绵羊BMPR-lB基因表达有显著抑制作用的shRNA分子，为绵羊生物学研究拓展了应用领域。

发明内容

本发明的目在于：获得对BMPR-1B基因表达具有显著抑制效果的shRNA分子，在mRNA水平上抑制BMPR-IB基因表达效率90%以上。

 本发明的目的是这样实现的：一个抑制BMPR-1B基因表达合成的shRNA分子，依据GeneBank 中绵羊BMPR-1B基因，即NM-001009431.1序列；设计2条shRNA分子，将合成的两条互补单链的shRNA分子经退火形成双链后，连接到pLL3.7慢病毒干扰载体上,构建慢病毒干扰RNA质粒，将pLL-BMPR-IB-shRNA干扰RNA质粒与BMPR-IB表达载体经脂质体转染293T细胞产毒，经荧光定量PCR检测，得到了1个能显著抑制BMPR-IB基因表达的shRNA分子； 

其中使用的引物：

LV-BMPR-lB-1475

上游: 

5’TTGAGAGAGATCGTGTGTATTTCAAGAGAATACACACGATCTCTCTCATTTTTTC-3’；

下游: 

5’TCGAGAAAAAATGAGAGAGATCGTGTGTATTCTCTTGAAATACACACGATCTCTCTCAA-3’；

其中获取shRNA分子的步骤: 

其1  shRNA慢病毒载体的构建