[发明专利]ZFNs介导的牛MSTN基因敲除和定点整合外源基因的方法

权利要求书

1.ZFNs介导的牛MSTN基因敲除和定点整合外源基因的方法，其特征在于，其是根据牛肌肉抑制素基因序列，设计ZFNs特异位点表达载体，并根据ZFNs作用位点设计含有外源基因的且可以整合至宿主基因组中的打靶载体，然后将上述表达载体和打靶载体共同转入牛的成纤维细胞中，获得牛肌肉抑制素基因敲除且定点整合外源基因的细胞；其中，设计特异的锌指蛋白核酸酶ZFNs，其作用的DNA序列位于牛MSTN基因的外显子上。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，ZFNs作用的DNA序列位于牛MSTN基因的第2外显子和/或第3外显子上。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，ZFNs作用的DNA序列为：CTCATCAAACCCATGAAAGACGGTACAAGGTATACTGG和/或TTCCCAGAACCAGGAGAAGATGGACTGGTA。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述打靶载体含有根据ZFNs作用位点设计的牛MSTN基因5’同源臂和3’同源臂。

5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述外源基因为脂肪酸去饱和酶fat-1基因，或fat-1基因经过人源化修饰后的基因。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：

方案I：

1）构建bZFN-1和bZFN-2表达载体，它们的碱基序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；

2）根据ZFNs作用位点构建含有外源基因的且可以整合至宿主基因组中的打靶载体pflrk-1，其碱基序列如SEQ ID NO:5所示；

3）将上述表达载体和打靶载体共同转入牛的成纤维细胞中，通过PCR产物测序检测牛肌肉抑制素基因敲除且定点整合外源基因的细胞；和/或

方案II：

1）构建bZFN-3和bZFN-4表达载体，它们的碱基序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示；

2）根据ZFNs作用位点构建含有外源基因的且可以整合至宿主基因组中的打靶载体pflrk-2，其碱基序列如SEQ ID NO:6所示；

3）将上述表达载体和打靶载体共同转入牛的成纤维细胞中，通过PCR产物测序检测牛肌肉抑制素基因敲除且定点整合外源基因的细胞。

7.根据权利要求1-6任一项所述方法获得的牛肌肉抑制素基因敲除且定点整合外源基因的细胞。

8.权利要求1-6任一项所述方法在生产牛MSTN基因敲除且定点整合外源基因的克隆牛中的应用。

9.一种制备牛MSTN基因敲除且定点整合外源基因的牛克隆胚胎的方法，其以权利要求7所述牛肌肉抑制素基因敲除且定点整合外源基因的细胞为核移植供体细胞，离体的卵母细胞为核移植受体细胞，通过核移植技术获得牛克隆胚胎。

10.一种制备转基因牛的方法，其是将权利要求9所述方法制备的克隆胚胎通过非手术法移入牛子宫内进行妊娠，获得转基因牛。