[发明专利]一种用蓝子鱼内脏提取液制备细齿麒麟菜的原生质体的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种原生质体的制备方法。

背景技术

细齿麒麟菜是重要的产ι-卡拉胶红藻，具有广阔的市场开发和应用前景。在我国，细齿麒麟菜除生产ι卡拉胶用于食品和药品加工制造外，还可直接用来加工成凉拌速食产品，仅凉拌速食产品一项我国每年消耗约2000吨干品。

国际上细齿麒麟菜栽培多在热带和亚热带地区进行，细齿麒麟菜主产于印度尼西亚和菲律宾等东南亚国家和地区。以往该藻规模栽培主要依赖于营养繁殖，而该藻的孢子繁殖和有性生殖方式已经严重退化，造成种质退化、生长缓慢、产胶性能降低和抗病能力下降。

至今为止，细齿麒麟菜的育苗育种工作，在国内外尚没有重大突破。如果能够通过制备原生质体，进而结合细胞融合和愈伤组织等生物技术培育优良品种，将会对细齿麒麟菜的育种有巨大作用。

发明内容

本发明的目的是针对上述问题，提供一种能够制备优良的原生质体的方法，从而为进一步的育种提供良好的基础。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案是，一种用蓝子鱼内脏提取液制备细齿麒麟菜的原生质体的方法，所述方法包括如下步骤：

（1）用细齿麒麟菜饲喂蓝子鱼；

（2）从蓝子鱼内脏获得粗酶提取液；

（3）用所述粗酶提取液酶解细齿麒麟菜以获得原生质体。

优选的，所述步骤（1）中用细齿麒麟菜饲喂蓝子鱼的时间为7天或更长时间。

优选的，步骤（2）中所述蓝子鱼内脏是蓝子鱼的胃和/或肝脏。

优选的，所述步骤（2）中获得粗酶提取液是由新鲜蓝子鱼内脏在pH值6.0的50 mM磷酸缓钠盐缓冲液中冰冻研磨、匀浆和过滤获得。

优选的，所述步骤（3）中用粗酶提取液酶解细齿麒麟菜过程中要添加渗透剂和膜稳定剂。

优选的，所述渗透剂为甘露醇，所述膜稳定剂为氯化钙。

优选的，所述步骤（3）用粗酶提取液酶解细齿麒麟菜过程中要添加0.5%的纤维素酶和0.5%的果胶酶，并在酶解过程中保持震荡。

优选的，所述在酶解过程中保持震荡为在25℃条件下保持震荡速度100转/分钟。震荡强度过大会造成原生质体发生破裂，制备的效果不好，因此应保持轻微震荡。

本发明具体步骤如下：

1）利用细齿麒麟菜饲喂杂食性热带蓝子鱼，饲喂时间7天或更长时间，充分诱导蓝子鱼产生能分解细齿麒麟菜的酶类，备用；

2）取用细齿麒麟菜饲喂后的蓝子鱼，分离其胃、肝脏等内脏，冰冻；然后将冰冻后的蓝子鱼胃和肝脏切成小块，置于4摄氏度预冷的容器和50 mM的磷酸缓钠盐缓冲液（pH值6.0）中，组织匀浆器研磨成匀浆，用不同孔径的滤纸过滤去除杂质，过滤液为可以消化细齿麒麟菜的蓝子鱼内脏酶粗提液；

3）将细齿麒麟菜切成小段，置于组织粉碎器中粉碎至藻泥；然后向其中放入一定比例的蓝子鱼内脏酶粗提液、渗透剂甘露醇和稳定剂氯化钙；同时，上述酶解液中，可添加0.5%的纤维素酶和0.5%果胶酶，强化分解细齿麒麟菜细胞壁的功能；在25℃条件下，轻微震荡并充分酶解10-12小时。

向酶解后的藻泥中，加入3ml洗脱液后放回摇床，继续在25℃条件下，震荡酶解1小时；然后，以细孔径的筛绢过滤酶解液，将滤液再转入到离心管中，在相对离心力为218g（湘仪 TGL-16M）的条件下离心5 min；弃去离心管中最上层的清液5ml，并向离心管中加入5ml洗脱液混匀，在相对离心力为218g的条件下重复离心5 min，弃掉上清，向离心管中加入1ml洗脱液，悬浮后转入1.5ml的离心管中，即为细齿麒麟菜原生质体。

本发明方法的优点在于：

1、原料易得。蓝子鱼终生喜食细齿麒麟菜，而且该鱼种分布广、易于获得，该鱼的摄食速度快量大，因此其消化系统内有分解该藻的酶类，而且酶活性较强；

2、结果完整、稳定，通过本发明方法能够获得具有完整结构的没有细胞壁的原生质体，为接下来的通过原生质体愈合和组织培养途径，进行种质种苗培育奠定良好基础。

附图说明

图1为用蓝子鱼内脏提取液制备的细齿麒麟菜原生质体；

图2为细齿麒麟菜原生质体样品经伊文思蓝染色后的照片。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附后权利要求书限定的范围。

实施例1,