[发明专利]激光差动共焦图谱显微成像方法与装置

说明书

技术领域

本发明属于光学显微成像及光谱测量技术领域，涉及一种激光差动共焦图谱显微成像方法与装置，可用于各类样品的三维形貌重构及微区光谱探测。

技术背景

1990年G.J.Puppels等在Nature期刊报道其发明的将拉曼光谱探测技术与激光共焦显微技术结合的激光共焦拉曼光谱显微技术，是拉曼技术的一次革命性突破。该技术既继承了共焦显微术的高分辨层析成像特征，又可以对样品进行光谱分析，因此可以实现对样品微区光谱的高分辨层析探测。此显著优点使激光共焦拉曼光谱显微技术在光谱测试领域独树一帜，并且迅速发展为一种极其重要的样品结构与成分分析的重要手段，使之广泛应用于化学、生物学、医学、物理学、地质学、法庭取证、刑侦学等学科的前沿基础研究中。

目前，典型的激光共焦拉曼光谱探测仪的原理如图2所示，激光沿光路依次经过第一聚光镜、第一针孔、第八聚光镜、第一分光系统、四分之一波片、物镜后，聚焦在被测样品上，激发出载有样品光谱特性的拉曼散射光；移动被测样品，使对应被测样品不同区域的拉曼散射光再次通过四分之一波片并被第一分光系统反射，经过第四聚光镜、第四针孔、第五聚光镜后聚焦进入第一光谱仪进行光谱探测。

现代科技的快速发展对微区光谱探测能力及空间分辨探测能力提出了更高的要求，若要提高空间分辨力，必须对系统进行精确定焦。在光学探测系统中，当测量聚焦光斑位于焦点时其尺寸最小，激发光强最强，因此为了获得高空间分辨力，必须能够捕获到激发光强最强处的光谱，从而获得其最佳空间分辨力和最优的光谱探测能力。如图1所示，现有的共焦显微技术在激光激发焦点O附近的BB′区域内，均能激发出样品的拉曼光谱，并能被针孔后的光谱探测系统探测。因而共焦拉曼光谱显微技术的实际探测位置往往处于共焦曲线中离焦的BA和A′B′区，从而导致实际探测的“微区”远大于测量光束焦点O处光斑尺寸，同时，应用拉曼光谱进行共焦定位信噪比较低，并且由于针孔的遮挡作用会进一步降低拉曼光谱的能量，而扩大针孔尺寸提高光谱通过率则会增加共焦轴向定位曲线的半高宽，降低其定位精度，而现有共焦拉曼系统中的共焦针孔尺寸通常在150μm～200μm之间，所用针孔尺寸相对较大，亦不能很好的起到定焦作用。上述原因限制了共焦拉曼光谱显微系统探测微区光谱的能力，制约了其在更精细微区光谱测试与分析场合中的应用，因而提高系统的定焦精度是提高其空间分辨力的关键。

1996年Kimberley F等人在《Description and Theory of a Fiber-Optic Confocal and Super-Focal Raman Microspectrometer》中提出用光纤束代替共焦拉曼光谱显微镜的针孔的方法，实现“针孔”尺寸的非机械调节，其在扩大“针孔”时，并不降低系统的光谱分辨力；2007年E Kenwood Blvd等在《Very efficient fluorescent background suppression in confocal Raman microscopy Department of Physics》中提出通过使用3-4ps的皮秒激光器结合相应的瞬时曝光技术使样品测量的荧光背景降低了约3个数量级，提高了共焦拉曼光谱显微术的分辨力；2008年N.Everall等在《The Influence of Out-of-Focus Sample Regions on the Surface Specificity of Confocal Raman Microscopy》中指出采用大数值孔径(NA=1.4)油浸物镜，可获得了比传统共焦拉曼光谱仪更高的轴向分辨力和信噪比，但是这种方法需要对样品进行制片，不能实现非接触和无损测量，限制了系统的应用范围；2009年M.J.Pelletier和Neil J.Everall等在《Control of Out-of-Focus Light Intensity in Confocal Raman microscopy using optical preprocessing》中提出利用校正物镜或结构光瞳掩模消除了离焦位置拉曼散射的光谱强度的干扰，提高了光谱探测效率，大大降低了共焦拉曼系统离焦拉曼光谱对其有效深度分辨力的影响。

上述研究，主要集中在共焦拉曼光谱显微系统涉及的光源系统、光谱探测系统、聚焦物镜系统、光谱信息处理等方面，虽然改善了光谱系统的总体性能，但在共焦拉曼光谱系统空间分辨能力的方面却没显著改善，提高拉曼光谱系统的空间分辨力仍是悬而未决的问题。