[发明专利]豌豆细菌性疫病菌荧光PCR快速检测引物及试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于植物检疫检测技术领域，具体涉及一种豌豆细菌性疫病菌荧光PCR快速检测引物及包含该引物的试剂盒。

背景技术

豌豆细菌性疫病菌(Pseudomonas syringae pv.pisi)是《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》中规定的检疫性有害生物，在世界各地分布较为广泛。寄主包括豌豆属、扁豆属、香豌豆属、野豌豆属、豇豆属、天蓝苜蓿等植物，可引起叶片、茎、花梗、花和豆荚等萎蔫枯死，导致植株猝倒，对产量影响较大，是各国严格限制入境的有害生物之一，也是我国进境植物检疫性病原细菌的一种，是进出境植物产品特别是豌豆源性产品的重要检疫对象。该病害由种子带菌，即使只有0.01％种子被感染也可导致严重的病发。

豌豆细菌性疫病菌的传统检测与鉴定方法主要为病菌分离及致病性测定、血清学检测技术、脂肪酸甲酯分析及核酸检测。分离及致病性测定一般需要3d以上的时间才能观察到有效症状。在脂肪酸甲酯分析中，提取细菌脂肪酸甲酯，用气相色谱法分析其成份比例，鉴定结果的敏感度与致病性测定方法结果相同。缺点是检测无症带菌植株的灵敏度不如选择性培养基。综上所述，这些传统方法方法费时，操作繁琐，不能满足病害防治的需要；

乙烯合成酶基因(ethylene-forming enzyme(efe)gene)基因是指作为豌豆细菌性疫病菌保守程度较高的序列，可被用来进行该菌的分子生物学检测和鉴定。现代检测技术越来越倾向于聚合酶链式反应法(PCR法)等分子检测手段，该方法较传统方法快速、灵敏，目前我国尚未见用荧光PCR方法检测豌豆细菌性疫病菌的方法。

发明内容

本发明的目的是提供豌豆细菌性疫病菌荧光PCR快速检测，即一种能够通过检测豌豆细菌性疫病菌基因(PSS-EFE)来判断检测样品中是否存在豌豆细菌性疫病菌的荧光引物。

本发明的荧光引物，包括：

1)序列为SEQ ID NO：1的上游引物和序列为SEQ ID NO：2的下游引物；

2)对1)中的引物对通过转换、插入、缺失或5’添加基所形成的引物对，且引物对扩增的产物在严谨条件下与1)的引物的扩增产物发生杂交；

3)在1)或2)所描述的扩增片段上设计得到的引物对

本发明的豌豆细菌性疫病菌的荧光PCR快速检测试剂盒，包括如下组分

1)2倍浓度的PCR体系预混合物；

2)上游引物和下游引物，浓度分别为10μmol/L；

3)20倍浓度的荧光染料；

4)DNA样品/报告质粒，10μg/μL；

5)双蒸水。

本发明根据PSS-EFE基因保守序列，通过分子生物学分析获得了特异性引物，该保守基因序列为具有EFE基因的不同豌豆细菌性疫病菌株系所共有，以保证从种的水平上检测不同来源的PSS-EFE基因的可靠性。另外，本发明的引物采用荧光标记，与普通PCR技术相比，不必用凝胶电泳方法来观察，实现了检测流程一体化封闭检测。

具体实施方式

1、本发明根据PSS-EFE基因保守序列，通过分子生物学分析获得了特异性引物，该引物包括：

1)序列为SEQ ID NO：1的上游引物和序列为SEQ ID NO：2的下游引物；

2)对1)中的引物对通过转换、插入、缺失或5’添加基所形成的引物对，且引物对扩增的产物在严谨条件下与1)的引物的扩增产物发生杂交；

3)在1)或2)所描述的扩增片段上设计得到的引物对

2、对于2)中描述的引物，包括在引物的5’添加了内切酶识别标识片段所形成的长度不同引物，以及碱基替换、插入、删除所形成的变异引物。这些由序列为SEQ ID NO：1的上游引物和序列为SEQ ID NO：2的下游引物所衍生出的引物也能用来检测豌豆细菌性疫病菌，即2)中所描述的衍生引物所扩增出的核苷酸片段能够在严谨条件下与1)的引物的扩增产物发生杂交；所述的严谨条件参照Roche公司的DIG高效DNA标记及检测Starter Kit1手册中的杂交条件。

本发明的引物用于荧光PCR检测PSS-EFE基因，PCR反应体系中各组分构成比例如下：

PCR反应程序：

(1)94℃预变性3min；

(2)94℃变性25s；55℃退火，30s，72℃延伸30s，循环40次。

(3)最后加做熔解曲线(95℃15sec，60℃15sec，95℃，15sec)