[发明专利]一种灰葡萄孢特异性PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物检测领域。具体涉及一种灰葡萄孢特异性PCR检测方法，该方法检测时间短，成本低，结果特异，结果判定简单，灵敏性高。

背景技术

灰葡萄孢（Botrytis cinerea）按照最新的分类系统，其无性态属于半知菌类，丝孢纲，丝孢目，暗丛梗孢科，葡萄孢属。有性态属于子囊菌门，盘菌纲，柔膜菌目，核盘菌科，葡萄孢盘菌属。

灰葡萄孢是一种兼性寄生菌，在植物生长的任何阶段均可侵染植物的地上部位，产生大量的分生孢子，可随风、水以及农事操作等传播从而进行再侵染，其腐生性强，引起的病害灰霉病是一类顽固性病害。在已报道的葡萄孢属真菌中，灰葡萄孢寄主范围最广，可以侵染蔬菜（如番茄、黄瓜、茄子、辣椒、豆类等）、大田作物（如油菜、小麦等）、水果（桃、梨、葡萄、草莓、苹果等）和花卉（如月季、康乃馨、百合花、郁金香等）。此病原菌喜低温高湿，其发病适温一般为20~25℃，因其发病适宜温度与绝大多数保护地蔬果生长的适宜温度相近，作物一旦被侵染，会突然暴发灰霉病并蔓延，由于病原量大难防治，从而造成严重的经济损失。

葡萄孢属真菌主要包括：Botrytis cinerea（灰葡萄孢）、B.fabiopsis（拟蚕豆葡萄孢）、B.fabae（蚕豆葡萄孢）、B.sinoviticola（中国葡萄生葡萄孢）、B.elliptica（椭圆葡萄孢）、B.squamosa（葱鳞葡萄孢）、B.porri（大蒜盲种葡萄孢）、B.sinoallii（中国葱葡萄孢）、B.aclada（葱腐葡萄孢）、B.byssoidea（葱细丝葡萄孢），其近缘属真菌主要包括：Amphobotrys ricini、Verrucobotrys gernii、Streptobotrys caulophylli，它们在寄主上引起的症状相似，在田间无法区分病原种类。而通过分离培养，以及从形态学角度进行病菌鉴定所需时间较长，从而延误病害防治。因此迫切需要一种简单、快速、特异性强、灵敏性高的病原检测方法。

本发明依据真菌基因组DNA的多样性，参考已经完善的RAPD（随机扩增多态性DNA片段）方法，扩增灰葡萄孢、葡萄孢属其它种真菌及其近缘属真菌，获得灰葡萄孢特异性DNA片段并测序，依据所得序列设计灰葡萄孢特异性引物，并提出一种更方便、省时灰葡萄孢特异性PCR检测技术。本发明大多数菌株参考文献（张静.湖北省灰霉病病菌区系和灰葡萄孢多样性研究.华中农业大学，博士学位论文，2010）中已经鉴定的真菌。所有试验菌株来源于华中农业大学农业微生物国家重点实验室植物病原真菌李国庆课题组。同时，本发明依据通用引物对ITS1、ITS4扩增真核生物ITS1-5.8S-ITS2（真核生物核糖体内转录间隔区）部分区域来验证本发明中所有样品是否含真核生物DNA，证实本发明中实验的可靠性。

虽然已经有学者通过设计特异性PCR引物的方法检测灰葡萄孢，但是所需PCR反应时间长，并且只提供了特异性PCR引物扩增黄瓜霜霉病菌、黄瓜白粉病菌、辣椒疫霉病菌三种真菌的检测结果，其中，黄瓜霜霉病菌、辣椒疫霉病菌属于鞭毛菌门真菌，而黄瓜白粉病菌属于子囊菌门核菌纲真菌，这三种真菌与葡萄孢属相隔甚远容易区分。并未对葡萄孢属其它种及近缘属其它真菌进行特异性检测，且其特异性PCR引物灵敏性也仅限于微克级别。

本发明克服现有技术的不足，提供一种灰葡萄孢特异性PCR引物及PCR检测技术。采用本发明的检测方法检测灰葡萄孢，时间短，成本低，结果特异，结果判定简单，灵敏性高，更加具有实用性。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种灰葡萄孢新的特异性PCR检测方法。采用本发明的检测方法检测灰葡萄孢，时间短，成本低，结果特异，结果判定简单，灵敏性高。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明提供了一种灰葡萄孢新的特异性PCR检测方法，包括如下步骤：

步骤一，通过查找文献及参考上海生工生物工程股份有限公司提供的RAPD引物，选择23个随机引物（见表1），扩增灰葡萄孢及其近缘种（见表3）基因组DNA，根据扩增结果凝胶电泳图比较所有菌株多态性条带，扩增灰葡萄孢所得特异性条带最清晰、最稳定即为所需RAPD引物，最后选定RAPD引物OPE-11，回收灰葡萄孢特异性片段，测得其序列如SEQ ID NO:1所示，设计扩增引物对：B1SE11f（SEQ ID NO:2）和B1SE11r（SEQ ID NO:3）。