[发明专利]miR-200a抑制胰腺癌干细胞干性特征的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种抑制胰腺癌干细胞干性特征的方法。

背景技术

现有的科学研究中，经常需要进行抑制胰腺癌干细胞干性特征，但现有的方法在操作方便性、成本、效果等方面存在不理想之处。

发明内容

本发明的目的在于提供一种操作方便，效果好的miR-200a抑制胰腺癌干细胞干性特征的方法。

本发明的技术解决方案是：

一种miR-200a抑制胰腺癌干细胞干性特征的方法，其特征是：包括下列步骤：

A）人胰腺癌细胞系PANC-l培养

以含10％胎牛血清（FBS）的DMEM培养液为培养基，在37℃、5％CO₂饱和湿度条件下培养人胰腺癌细胞系PANC-l，每2-3天传代一次，每传代一次用0.25％胰蛋白酶消化；

B）流式细胞仪检测和分选胰腺癌干细胞

（1）将PANC-1癌细胞消化成单细胞悬液

细胞生长达对数生长期后，吸去培养液，PBS洗1遍，加入0.25％胰蛋白酶，37℃消化5min；待细胞变圆，加入含血清的完全培养基（即含10％胎牛血清的DMEM培养液），吸管吹打数次；移入无菌离心管，1000r／min离心5min，PBS液重悬细胞，血球计数板计数；

（2）抗体孵育

每1×10⁶个细胞分别加入20μl PE标记的抗人CD24（anti-CD24 phycoerythrin）、APC标记的抗人CD44（anti-CD44allophycocyanin）和FITC标记的抗人ESA（anti-ESA-FITC），稀释度均为1:40，冰浴30min，PBS清洗2次；对照组不加抗体；应用流式细胞仪进行流式检测及分选(步骤按流式细胞仪说明书操作)，分选得到CD24⁺CD44⁺ESA⁺细胞亚群；

C）无血清悬浮培养PANC-l干细胞球细胞

(1)干细胞球的培养

将分选得到的CD24⁺CD44⁺ESA⁺细胞亚群用DMEM-F12培养基(含有B2750×、N2100×，表皮生长因子（EGF）10ng／m1、成纤维生长因子（FGF）20ng／m1、血小板衍生因子（PDGF）20ng/ml、青霉素100U／m1、链霉素100ug／m1)重悬，在37℃、5％CO₂的培养条件下培养，当培养至第5-7天时，形成球状；

(2)干细胞球的传代

当干细胞球长至第10天左右，1000r/min离心5min，去上清，用0.25％胰蛋白酶消化3min，加入胰酶抑制剂中和后吹打成单细胞悬液，接种于DMEM-F12无血清培养基中继续培养，为第二代PANC-l干细胞球，体外连续培养并传代；

D）过表达miR-200a

（1）合成miR-200a的前体片段和阴性对照；

（2）取对数生长期细胞进行细胞转染，按照InvitrogenLipofectamine2000说明书分别转染到胰腺癌干细胞中。

本发明操作方便，效果好，成本低。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

图1、图2、图3分别是流式细胞仪检测胰腺癌细胞表面标记物CD24、CD44和ESA表达结果图；

图4是胰腺癌细胞株PANC-1和流式细胞分选出的CD24⁺CD44⁺ESA⁺细胞亚群在培养基中的表型观察图。

图5是实时荧光定量PCR仪检测胰腺癌细胞PANC-1和CD24⁺CD44⁺ESA⁺细胞亚群中miR-200a的表达量示意图。

图6是CD24⁺CD44⁺ESA⁺细胞亚群中过表达miR-200a mimic后细胞表型变化图（图中A为未处理组，B为阴性对照组，C为miR-200a过表达组）。

图7、图8分别是CD24+CD44+ESA+细胞亚群中过表达miR-200amimic后实时荧光定量PCR仪检测miR-200a和胚胎干性基因Oct-4和Nanog基因的表达量示意图。

具体实施方式

一种miR-200a抑制胰腺癌干细胞干性特征的方法，包括下列步骤：