[发明专利]霍乱弧菌hlyA基因的质粒克隆菌株以及制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及霍乱弧菌全基因组DNA提取和hlyA基因的质粒克隆菌株、其制备方法及非疾病诊断目的方面的应用。

背景技术

霍乱是由霍乱弧菌(Vibrio cholerae)引起的烈性肠道传染病，能引起霍乱流行的霍乱弧菌主要有两种血清型，既O1群和O139群，霍乱弧菌的强致病作用主要是由其分泌的霍乱肠毒素导致严重腹泻所致，因此准确、快速的检测霍乱弧菌，特别是产毒霍乱弧菌，对于预防霍乱弧菌感染具有重要意义。随着分子生物学研究的发展，人们对细菌的侵袭素和毒力岛等毒力基因认识的不断深入，细菌的检测方法已经从传统的一般表型特征鉴定深化为遗传特征基因的鉴定。霍乱弧菌hlyA基因编码具有溶血-溶细胞的蛋白，是弧菌属高度保守的管家基因；霍乱弧菌rfb-O1基因和rfb-O139基因分别是O1群霍乱弧菌和O139群霍乱弧菌菌体抗原编码基因，ctxAB基因是分泌霍乱肠毒素的毒力标志，具有高度保守性。

由于霍乱弧菌的相关毒力基因、管家基因和功能基因总是成簇的位于染色体上，一般都在几kb到几十kb之间，难以用一般的PCR方法扩增并克隆这些基因。基因组文库(genomic library)是上世纪70年代末发展起来的一种分离基因组基因的新技术，它包含了基因组的全套遗传信息(即全部基因)，人们可用相应的基因探针从文库中钓取出任一特定的基因片段加以研究。目前宏基因组学的应用已成为研究已有基因和寻找新基因及其产物的一条新途径，载体包括Cosmid、Fosmid和BAC等，平均插入片段大于40Kb，Fosmid载体是一种替代Cosmid载体构建大片段文库的新载体，与BAC文库构建相比，Fosmid文库稳定性、随机性好、技术成熟、构建更简单快速。Fosmid载体由于插入了大肠埃希菌致育因子F^一因子，所以它在宿主菌中以单拷贝形式存在，稳定性好。并且载体上有一个可诱导的oriV高拷贝复制起始点，需要时可诱导达到高拷贝(50个左右)。另外，Fosmid文库随机性好，保证了每段DNA在文库中出现的频率均等。

为了防止“生物安全事故”而引发“公共卫生事件”，国内外均一致要求在PIII或PII生物安全实验室内对霍乱弧菌可疑样品进行检测，通过构建霍乱弧菌Fosmid文库的目的就是要把霍乱弧菌染色体的全部基因克隆到易于培养的大肠杆菌中，筛选出霍乱弧菌hlyA基因、rfb-O1基因、rfb-O139基因和ctxAB基因单克隆菌株，霍乱弧菌克隆基因的宿主菌为大肠杆菌，不需要培养活的霍乱弧菌菌株，所以可以在PI生物安全实验室进行操作，有利于生物安全防护；同时也是研究霍乱弧菌的致病机理、潜伏机制、血清学变异机理、基因疫苗的制备和基因结构及功能等分子生物学特性的前提；而且有利于进行霍乱弧菌的基因功能的研究和满足地方基层实验室应对霍乱疫情和疫源地疫情检测时快速检测霍乱弧菌的需要。

发明内容

本发明的目的在于提供霍乱弧菌(Vibrio cholerae)全基因组DNA提取方法和霍乱弧菌(Vibrio cholerae)hlyA基因的单克隆菌株，主要用于霍乱弧菌相应基因检测的阳性对照样品，进行质量控制，也可用来考核检验人员的技术水平，以保证检验工作质量；并且可以对不同的分析方法和不同的鉴定仪器进行检验和校准，使之具有准确性、统一性、可比性和规范性。

本发明的一方面在于提供一种霍乱弧菌(Vibrio cholerae)hlyA基因的质粒克隆菌株，其以大肠杆菌pCC1FOS为载体，转化了霍乱弧菌的hlyA基因的质粒克隆菌株，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC NO.6999。

本发明的另一方面在于提供一种霍乱弧菌hlyA基因检测试剂盒，其包括上文所述的保藏编号为CGMCC NO.6999的质粒克隆菌株作为阳性对照，及上下游引物与探针：SEQ IDNO.4；SEQ ID NO.5；SEQ ID NO.6。

此外，试剂盒中还可以包括用于PCR扩增的2×PCR Taqman GEx酶预混液等试剂，本领域技术人员可依据试剂盒所应用的PCR反应类型，确定所需的缓冲液或扩增酶等试剂种类。

本发明的再一方面在于提供一种非疾病诊断目的的，霍乱弧菌hlyA基因的多重PCR检测方法，其利用上文所述霍乱弧菌hlyA基因检测试剂盒，对样品DNA进行多重PCR方法检测。

对于上述技术方案中，优选的情况下，所述的多重PCR方法检测的条件为：

①反应体系总体积为20μL，其中：