[发明专利]一种产S-3-羟基丁酮基因工程菌及其构建方法与应用

说明书

技术领域

本发明属于生物化工领域，具体涉及一种产基因工程菌及其构建方法和应用。

背景技术

3-羟基丁酮又名甲基乙酰甲醇、乙偶姻，可作为一种平台化合物，广泛应用于日化食品、制药、涂料、液晶材料等众多领域。2004年，美国能源部将其列为30种优先开发利用的平台化合物之一。3-羟基丁酮存在2个旋光异构体，分别为R型和S型3-羟基丁酮，S-3-羟基丁酮可用于合成4-氯-4,5-二甲基-1,3二氧杂环戊烷-2-酮(CDMDO)，CDMDO是合成青霉素、氨苄青霉素等抗生素类药物重要的医药中间体；S-3-羟基丁酮还可以用于合成抗菌药伦氨苄西林盐酸盐的中间体——4-溴甲基5-甲基-1,3-二氧戊环-2-酮。近年来，随着人们对S-3-羟基丁酮需求的不断增长，有关S-3-羟基丁酮的生产方法及应用研究已引起人们的广泛关注。

目前S-3-羟基丁酮的合成方法主要有两种：一是化学合成法，二是生物合成法。化学合成法存在反应步骤多，还需手性拆分，工艺繁琐，导致成本高、收率底，环境污染比较严重，且原料大都是不可再生的化石资源——石油，原料来源受到限制。生物合成法包括酶法和微生物发酵法，酶法是以丁二酮或丁二醇为原料，在酶的催化特异性作用下生产S-3-羟基丁酮，该方法转化率和光学纯度均能达到100%，但是和化学法一样原料来源受到限制，且产量偏低，难以大批量制备S-3-羟基丁酮。

目前用于3-羟基丁酮生产及研究的菌株主要有克雷伯氏菌属(Klebisella)、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、肠杆菌属(Enterobacter)以及沙雷氏菌属(Serratia)等，但是尚未发现用于生产光学纯S-3-羟基丁酮的野生菌株。目前文献报道的利用基因工程手段构建质粒转化大肠杆菌得到重组菌生产S-3-羟基丁酮，研究者将Bacillus subtilis 168中的2,3-丁二醇脱氢酶基因（Bud A）导入大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中，构建重组菌E.coli BL21-Bud A，并以meso-2,3-丁二醇为底物利用该重组菌转化制备S-3-羟基丁酮，虽然获得成功，产量在36.7g/L左右，但是该方法依然存在底物meso-2,3-丁二醇价格昂贵且难以获得，并存在重组质粒不稳定的问题，产量低，成本高等缺陷。（Xiao Zijun，Plos One5(2010，1)1-6）

发明内容

发明目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种产S-3-羟基丁酮基因工程菌。

本发明所要解决的第二个技术问题是提供上述产S-3-羟基丁酮基因工程菌的构建方法。

本发明还最后要解决的技术问题是提供上述产S-3-羟基丁酮基因工程菌的应用。

技术方案：为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种产S-3-羟基丁酮基因工程菌，其分类命名为paenibacillus polymyxa CGMCC 3044-Bud A^-，该工程菌是通过下列方法构建得到的：利用PCR技术从多粘类芽孢杆菌paenibacillus polymyxa CGMCC 3044中扩增出2,3-丁二醇脱氢酶基因Bud A，5’端39bp碱基序列构成同源臂Ⅰ，3’端20bp碱基序列构成同源臂Ⅱ，通过多克隆位点将同源臂Ⅰ和同源臂Ⅱ分别串联到携带λRed同源重组序列克隆粘粒SuperCos-1/pIJ790的oriT复制起始序列和阿泊拉霉素抗性基因Apra^R序列的两端，得到含“Bud A同源臂Ⅰ-oriT-Apra^R-Bud A同源臂Ⅱ”序列的重组粘粒SuperCos-1/pIJ790-Bud A同源臂Ⅰ-oriT-Apra^R-Bud A同源臂Ⅱ，重组粘粒转化paenibacillus polymyxa CGMCC 3044，并在λRed介导下与paenibacillus polymyxa CGMCC 3044发生同源双交换，得到重组的多粘类芽孢杆菌，即产S-3-羟基丁酮基因工程菌paenibacillus polymyxa CGMCC 3044-Bud A^-。

其中，SuperCos-1/pIJ790中SuperCos-1为粘粒；质粒pIJ790携带λRed同源重组序列、oriT复制起始序列和阿泊拉霉素抗性基因Apra^R等序列。