[发明专利]一种用于构建无筛选标签蓝细菌的载体及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及蓝细菌基因工程领域，具体而言是一种用于构建无筛选标签蓝细菌的载体及其应用。

背景技术

蓝细菌广泛分布于地球各种环境中，是一类能够进行植物型光合作用的原核生物。1996年，日本Kazusa研究所完成了蓝细菌集胞藻PCC6803全基因组测序工作，这是第一个完成全基因组测序的光合生物；到目前为止，已经有约40多种蓝细菌基因组被测序完成。另外，由于蓝细菌具有细胞结构简单、易于培养、生长相对迅速、遗传操作简单方便等优势，包括集胞藻PCC6803、聚球藻PCC7942和鱼腥藻PCC7120在内的一些蓝细菌菌株，成为光合作用、昼夜节律和固氮机理等研究的重要模式生物。

近年来，在能源和环境危机的背景下，基于生物质资源的通过生物或化学转化制备生物燃料的研究再次成为研究热点。而蓝细菌由于具有高效的光合作用能力、清晰的遗传背景、简单方便的遗传操作体系等优势，又被改造成为新一代光合能源微生物系统（Angermayr,S.A.,et al.(2009).“Energy biotechnology with cyanobacteria”,Curr OpinBiotechnol20(3):257-263.），用于合成各种生物燃料分子，如乙醇（Dexter,J.and Fu,P.(2009).“Metabolic engineering ofcyanobacteria for ethanol production”,Energy & EnvironmentalScience2(8):857-864.；Gao,Z.,H.Zhao,et al.(2012).″Photosynthetic production of ethanol from carbon dioxide ingenetically engineered cyanobacteria.″Energy & EnvironmentalScience5(12):9857-9865.）、正丁醇（Lan,E.I.and J.C.Liao(2012).″ATP drives direct photosynthetic production of 1-butanol incyanobacteria.″Proc Natl Acad Sci U S A109(16):6018-6023.）、异丁醇（Atsumi,S.,et al.(2009).“Direct photosyntheticrecycling of carbon dioxide to isobutyraldehyde”,Nat.Biotechnol.27:1177-1180.）、脂肪醇（Tan,X.,L.Yao,et al.(2011).″Photosynthesis driven conversion of carbon dioxide to fattyalcohols and hydrocarbons in cyanobacteria.Metab Eng13(2):169-176.）、脂肪酸（Liu,X.,J.Sheng,et al.(2011).″Fatty acidproduction in genetically modified cyanobacteria.″Proc Natl AcadSci U S A108(17):6899-6904.）和脂肪烃（Schirmer,A.,M.A.Rude,et al.(2010).″Microbial biosynthesis of alkanes.″Science329(5991):559-562.）等。自2009年以来，相关研究证明了基因工程蓝细菌合成生物燃料的可能性和巨大应用潜力，也引起了国际上学术界和工业界的高度关注。不过，产品产率不高以及由此引起的生产成本过高，又成为限制了基因工程蓝细菌合成生物燃料路线产业化应用的主要瓶颈问题。

为了不断提高蓝细菌合成生物燃料的产量，对蓝细菌基因组系统地遗传改造工作就显得十分重要。传统的蓝细菌遗传操作手段多通过同源重组的方式将筛选标签（多为抗性筛选标签）插入待改造基因位点中或置换其部分编码序列。这种遗传改造方式依赖于可用的抗性筛选标签数目，已经不能满足多基因位点（3个以上）乃至基因组范围的遗传改造工作。因此，开发一种能够在蓝细菌中切除筛选标签，构建无筛选标签突变株的方法，对于蓝细菌系统地遗传改造工作，和基因工程蓝细菌生产生物燃料研究具有重要的意义。