[发明专利]一种绵羊肺炎支原体的快速定性检测方法

权利要求书

1.一种绵羊肺炎支原体的快速定性检测方法，其特征在于该方法的步骤如下：

A. 模板DNA的制备

（1）取100g组织进行匀浆，再把匀浆后的组织4000 r/m离心5min，取上清，上清11000r/m离心30min，弃上清；若是细菌培养物，则取1ml细菌培养物于1.5ml离心管中，11000r/m离心30min，弃上清；

（2）取500μL STE悬浮沉淀，加入20μL 10% SDS、10μL 10mg/mL蛋白酶K，混匀后于56℃水浴消化1.5h；

（3）加入与在步骤（2）得到的溶液等体积的苯酚、氯仿和异戊醇混合物，他们的体积比是25:24:1，混匀，10000r/m离心5min；

（4）离心后步骤（3）获得的溶液分成上层水相、中间固相与下层有机相，吸取上层水相，加入与所述水相等体积的异戊醇-氯仿混合物，混匀后10000r/m离心3min，取上清液；

（5）往上述上清液中加入0.1倍体积的5mol/L NaCl和2倍体积的无水乙醇，混合均匀，10000r/m离心3min，得到DNA沉淀；

（6）所述沉淀用70%（体积比）乙醇水溶液洗涤，10000r/m离心1min，弃乙醇，在室温下自然干燥，得到模板DNA，然后加入30μL灭菌去离子水溶解沉淀，于-20℃保存备用；

B. PCR扩增

反应体系25μL： 10×PCR buffer 2.5μL，25mM Mg²⁺  1.5μL， 2.5mM dNTPs 2μL，10μM上下游引物各1μL， 5U/μL Taq酶 0.125μL，50ng/μL DNA模板 2μL，灭菌双蒸水补足至25μL；PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃终延伸10min，16℃结束反应；取5μL PCR产物使用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳检测，并使用凝胶成像系统进行电泳图谱分析。

2.根据权利要求1所述一种绵羊肺炎支原体的快速定性检测方法，其特征在于结果及判断为：检测时以灭菌去离子水为模板，作为阴性对照；根据在135bp处出现预期特征条带，确定该样本中含有绵羊肺炎支原体，相反地则不含有绵羊肺炎支原体。

3. 根据权利要求1所述一种绵羊肺炎支原体的快速定性检测方法，其特征在于：所述上游引物HSP70F序列为5’-ACAACTCCTTCTGTTGTTGCCTT-3’，所述下游引物HSP70R序列为5’-AGCACGAACAGTTTTATCGCTAC-3’。