[发明专利]单抗介导的纳米金斑点渗滤法检测IBRV的试纸条

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，具体地说是一种抗牛传染性鼻气管炎病毒单克隆抗体及单抗介导的纳米金斑点渗滤法检测牛传染性鼻气管炎病毒的试纸条。 

背景技术

牛传染性鼻气管炎（Infectious Bovine Rhinotracheitis，IBR）是由牛疱疹病毒Ⅰ型（BHV-I）引起的一种病毒性传染病。BHV-I属疱疹病毒科，目前已知的有3个亚型：BHV1型、BHV2a、BHV2b型，但大多数学者认为只有一个血清型。该病最初在欧洲发生，20世纪30年代随着牛的输出而传到美国，Mille（1955）在美国首次报道了该病，Madin等（1956）分离到了该病病毒，1964年Hurk首先确认引起本病的病毒归属于疱疹病毒。目前该病广泛分布于世界各地，对肥育率、产奶量和繁殖影响极大，是引起养牛业重大经济损失的疾病之一。 

目前IBR诊断分为二大类，病原学检测和血清学检测。 

病原学诊断包括： 

1、病原分离鉴定；主要是分离培养病毒，将细胞培养的上清液与IBRV阳性血清或单克隆抗体（McAb）进行中和试验。也可采用免疫荧光或免疫过氧化物酶试验测定IBRV抗原。

2、直接免疫荧光试验：将从鼻、眼或生殖道采集的棉拭子直接涂抹于盖玻片上，或者离心取细胞沉淀滴在载玻片上，病理组织样品可做冰冻切片，进行免疫荧光直接法检测。该方法优点是较为快速，缺点是敏感性不高，非特异性反应相对较多。 

3．核酸检测：a.聚合酶链式反应（PCR），常用于PCR扩增的目的片段有TK、gB、gC和gD等基因；b.实时荧光PCR诊断，敏感性比常规PCR高10³～10⁴倍，适用于进出境牛传染性鼻气管炎感染的快速病原检测。c.核酸探针杂交技术：Southern Blot杂交试验是一种比较敏感的检测IBRV DNA的方法，Pandita （1995）和Xia等（1995）报道了用斑点杂交法检测IBRV。吴时友等（1998）报道的资料认为该方法的检测敏感性达到了可检出10pg的IBRV DNA，具有相当高的灵敏度和特异性。据报道，用生物素制备的改良型探针，代替了³²P，弥补放射性同位素探针半衰期短、对人体健康有害的弊端，可应用于检测牛精液中IBRV DNA，也取得了很好的结果，探针可在-20℃保存一年以上，有利于推广使用。 

血清学诊断： 

IBRV感染后常呈隐性感染，鉴定动物的感染状态采用血清学检查是非常实用且十分有价值的方法。抗体阳性动物除体内保有从初乳中获得母源抗体的犊牛和灭活疫苗免疫的牛之外均可认为是病毒携带者和潜在的间歇性排毒者，是重要的传染源。

1．病毒中和试验（国际贸易指定实验）：病毒中和试验被OIE指定为国际贸易试验方法之一，该方法是测定免疫血清是否具有中和病毒的能力。以病毒经不同稀释度的免疫血清中和后对细胞的感染力强弱为特征，得出该待检血清的中和效价。该方法被认为是血清抗体检测最经典、最标准的方法。通常的做法是固定病毒稀释血清法，用100 TCID₅₀测定倍比稀释的血清中和指数，血清（阳性对照血清、阴性对照血清、待检血清）均须56℃，30min灭活，用于国际贸易检疫时病毒血清孵育时间采用24h来提高敏感性。由于IBRV目前认为只有1个血清型，用1个已知标准毒株进行血清中和试验就可以做出确诊。但该方法存在操作复杂、试验周期长缺点，另外，对操作人员的操作熟练程度要求较高。 

2．酶联免疫吸附试验（国际贸易指定实验）：目前在大批量动物进出境检疫时首选的方法是ELISA，被推广使用主要包括间接ELISA和阻断ELISA。 

ELISA方法因具有简便、快速、准确优点，为目前检测IBRV主要选取方法之一，而且市场上已有多种商品化ELISA试剂盒，还可适用于检测牛奶中的gE糖蛋白抗体，但是，由于ELISA标准程序尚未建立，目前使用的ELISA试剂盒，多数为各自实验室自行建立自行使用，普遍尚未在国家参考实验室进行质量评估，缺乏足够的数据支持。霍烽等（2006）对国产试剂盒与中和试验的对比试验，发现主要存在有重复性差、敏感性不一致、与中和试验结果符合率变化大等问题。由此可见，出现假阳性或假阴性的几率较大，很难确保检疫质量，若使用进口的试剂盒价格高，检疫成本相应增高。