[发明专利]牛体外胚胎两段培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种新型的体外胚胎培养方法，具体地说，涉及合成输卵管液（SOF）在牛胚胎体外培养中的应用，可用于利用超排的或屠宰场卵巢获取的卵母细胞生产转基因克隆家畜、家畜育种及濒危物种的保护。属于应用型胚胎生物技术领域。

背景技术

体外胚胎培养技术是胚胎移植技术中重要的环节。采用超排卵或屠宰场来源的卵巢卵母细胞体外受精后进行体外胚胎培养，充分发挥优良母畜的繁殖潜力，为胚胎移植提供充足的胚源。该项技术的应用使得优良后代数量成倍增长，加快了优良品种扩繁和动物育种的步伐。基于该项技术的优势，目前已广泛应用于畜牧业生产，其中在牛单胎动物生产方面尤为突出。牛卵母细胞体外受精后进行胚胎培养，同时结合胚胎移植集成的MOET技术，加速了优良牛品种扩繁，缩短了世代间隔，提高了畜牧业生产效率，获得了巨大的经济及社会效益。

目前畜牧业生产中广泛使用SOF液进行牛体外胚胎生产，SOF液培养方法为胚胎全程培养7d。在培养7d后将获取的囊胚进行胚胎移植。尽管牛附植胚胎发育期间能够利用葡萄糖，但是许多研究发现SOF液内添加葡萄糖对早期胚胎发育有毒害作用，且一些研究表明体外培养期间葡萄糖降低了囊胚率。但是不添加葡萄糖或者葡萄糖浓度过低，同样不利于牛胚胎的发育。因此，体外培养期间如何通过合理的使用葡萄糖作为能源提高胚胎发育能力是目前亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种牛体外胚胎两段培养的方法；

本发明的另一个目的在于提供用于牛体外胚胎两段培养的培养试剂。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

牛体外胚胎两段培养方法，该方法首先将牛受精卵在含0.12～0.16mM葡萄糖的SOF液中培养2～3天，然后在含1.8～2.2mM葡萄糖的SOF液中培养4～5天。

优选地，该方法首先将牛受精卵在含0.15mM葡萄糖的SOF液中培养2天，然后在含2mM葡萄糖的SOF液中培养5天。

上述培养条件优选为含5%CO₂的空气，温度39℃，饱和湿度。

本发明还包括在牛受精卵培养前进行牛卵母细胞体外成熟和体外受精的步骤。

其中，卵母细胞体外成熟的方法是：将挑选出的A、B级卵丘卵母细胞复合体在洗卵液中清洗3次，成熟液清洗2次，然后放入预先在CO₂培养箱中平衡2h以上的成熟培养液中培养，培养条件为含5%CO₂的空气，温度39℃，饱和湿度，培养时间为24h。

其中，体外受精的方法是：采用培养皿微滴法，首先将成熟的卵母细胞在受精液中清洗2-3次后放入平衡好的受精液中；然后采用上浮法处理冷冻精液，精子在洗精液上浮20-30min，然后取上清600-800μl放入1.5ml离心管离心2次，离心后除去上清加入洗精液最终体积为250μl，取50μl处理后的精液加入已放入卵母细胞的受精液中，精子终浓度为1×10⁶精子/ml，培养条件为5%CO₂的空气，温度39℃，饱和湿度，受精时间为8h。

本发明还提供一种用于牛体外胚胎培养的试剂，其包括A液：含0.12～0.16mM葡萄糖的SOF液；和，B液：1.8～2.2mM葡萄糖的SOF液。

优选地，所述A液为含0.15mM葡萄糖的SOF液。所述B液为含2mM葡萄糖的SOF液。

本发明研究人员经过研究发现，在传统的SOF液的基础上，通过调整葡萄糖的浓度和培养时间提高了囊胚发育率，能够成为体外胚胎培养液在畜牧业生产上推广应用。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1牛胚胎体外培养

本发明通过采用两种含有不同浓度葡萄糖的SOF培养液培养牛胚胎建立新型的牛胚胎体外培养体系。主要采用两段培养方法：首先在胚胎含有0.15mM浓度的SOF液内培养5天，然后在含有2mM浓度的SOF液内培养2天后计数囊胚率，同时以含有0.15mM低浓度和2mM高浓度葡萄糖的SOF液标准一段培养为对照，培养7天计数囊胚率。

具体地说，使用本发明SOF液的牛胚胎体外培养方案：