[发明专利]沙门氏菌效应蛋白SopB的多克隆抗体的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域的抗体及其制备方法，具体的说是一种沙门氏菌效应蛋白SopB的多克隆抗体的制备方法。

背景技术

沙门氏菌效应蛋白SopB是由沙门氏菌SPI-1Ⅲ型分泌系统分泌的一种由561个氨基酸构成的蛋白质分子,是一种肌醇磷脂酶，是目前沙门氏菌分泌的效应蛋白中研究最多，功能最多样化的一个蛋白。沙门氏菌效应蛋白SopB首先作用于质膜，激活SH3-鸟核苷酸交换因子（SGEF），间接活化交换因子RhoG，从而进一步激活肌动蛋白，诱导细胞骨架重排，促使沙门氏菌侵入宿主细胞。沙门氏菌效应蛋白SopB能够激活原癌基因Akt₄₇₃的磷酸化，对细菌入侵介导的细胞凋亡具有抑制作用，促进宿主细胞的存活，为沙门氏菌在宿主细胞中的存活提供条件。同时，SopB通过招募RAB5和VPS34到SCV（Salmonella Containing Vacuole,SCV），促进SCV在宿主细胞内的形成和成熟，这对沙门氏菌在宿主细胞内的存活与复制具有重要的意义。此外，SopB能够激活宿主细胞蛋白激酶Erk1/2，p38和JNK的磷酸化激活，调控细胞核内基因的转录和翻译等功能。

虽然不同类型的沙门氏菌基因组间存在DNA水平的差异,但通过序列分析发现，在能够引起人类疾病的五大类沙门氏菌（如表1所示）中除了鸭沙门氏菌基因组未测序以外，SopB广泛存在于其他不同类型的沙门氏菌中，而且蛋白序列高度保守，足见其功能的重要性。因此，SopB的功能研究将为揭示沙门氏菌的致病机理，以及寻找沙门氏菌性肠道疾病的治疗靶点具有重要的意义。

表1.沙门氏菌效应蛋白SopB在不同类型沙门氏菌中的分布

沙门氏菌效应蛋白SopB包括561个氨基酸，其中，N端1-181个氨基酸的区域被发现是一个GTPase结合结构域，能够与宿主细胞中的Cdc42的Rho GTPase结构域互作，进而调控宿主细胞细胞骨架的重排和质膜内陷，帮助沙门氏菌的成功侵染。C端是具有肌醇磷脂酶活性的结构域，能够直接催化4,5-二磷酸磷脂酰肌醇去磷酸化生成5-磷酸肌醇，作为第二信使调控细胞骨架的重排。我们曾经在肠上皮细胞中异位表达沙门氏菌效应蛋白SopB，结果发现大量的细胞出现了死亡，说明沙门氏菌效应蛋白SopB对宿主细胞是有害的。因此不能够用沙门氏菌效应蛋白SopB的全蛋白作为免疫抗原。

经对国内外的公司以及实验室的抗体进行检索发现，到目前为止，尚未有沙门氏菌效应蛋白SopB的相应的抗体。经对文献进行检索发现，尚未有与沙门氏菌效应蛋白SopB抗体制备相关的研究报道。沙门氏菌效应蛋白SopB抗体的缺失限制了人们对沙门氏菌效应蛋白SopB进行免疫印迹分析、免疫组化分析以及双重免疫激光共聚焦的显微观察等研究，影响到了人们对沙门氏菌感染机制的深入研究以及抗感染药物的研发。

发明内容

本发明的目的是提供一种特异性好、灵敏度高、可与沙门氏菌感染宿主细胞的过程中分泌的内源性沙门氏菌效应蛋白SopB发生特异性结合的兔源多克隆抗体的制备方法。

本发明是通过以下的技术方案实现的：

一种沙门氏菌效应蛋白SopB的多克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：

步骤一，以沙门氏菌效应蛋白SopB全长氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的从N末端第29位至第168位共计139个氨基酸如SEQ ID NO:2所示的蛋白质序列为免疫原，采用常规多克隆抗体的制备方法制备抗血清；

步骤二，纯化抗血清，即得沙门氏菌效应蛋白SopB的多克隆抗体。

所述的沙门氏菌效应蛋白SopB的多克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：

步骤1，克隆编码沙门氏菌效应蛋白SopB N末端第29位至168位共计139个氨基酸的蛋白的如SEQ ID NO:9所示的SopB29-168核酸片段；

步骤2，将步骤1得到的SopB29-168核酸片段和pSUMO表达载体分别酶切后构建第一连接体系，转化大肠杆菌，筛选pSUMO-SopB29-168重组质粒；利用所得的pSUMO-SopB29-168重组质粒转化大肠杆菌，培养，融合蛋白的诱导，裂解，挂镍柱，Ulp1酶切，纯化后，得沙门氏菌效应蛋白SopB29-168；