[发明专利]一种抗杨尺蠖害虫的转基因欧美杂交杨

说明书

技术领域

本发明属于植物品种改良的生物技术，具体地涉及一种抗杨尺蠖害虫的转基因欧美杂交杨。

背景技术

杨树是世界上分布最广，适应性最强的树种，是我国重要的速生用材树种之一。然而，随着环境的不断恶化，自然灾害的频繁发生，食叶害虫和蛀干害虫的危害成为大面积发展杨树丰产林的最大障碍，化学防治方法不仅成本高、污染环境，而且易使害虫产生抗药性，因此，利用基因工程方法培育具有抗虫能力的杨树新品种是控制虫害的重要途径。林木植物由于生长周期较长，总是面临周围环境中各种病虫害的侵犯，因此在长期的演化过程中，他们自身已获得了适度、有效的生物抗性机制，能够最大限度地避免逆境的危害。通过深入挖掘并利用林木植物这种自身的病虫害防御机制，利用基因工程方法培育转基因抗虫林木新品种，对发展生态林业、保护生态环境具有重要意义。

WIN4是一种杨树叶片创伤后诱导表达的蛋白，目前仅被描述为一种营养储存蛋白，尚无文献资料报道其对杨树主要食叶害虫之一——鳞翅目杨尺蠖具有抗虫能力。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种抗杨尺蠖害虫的转基因欧美杂交杨。

本发明的技术方案概述如下：

一种抗杨尺蠖害虫的转基因欧美杂交杨，是用下述方法获得：

（1）以杂交杨（Populus trichocarpa×Populus deltoides）叶片的总RNA为模板，以SEQID No.2、SEQ ID No.3所示核苷酸序列为上、下游引物，通过RT-PCR得到了SEQ ID No.1表示的核苷酸序列；

（2）将凝胶回收的SEQ ID No.1表示的核苷酸序列连接到pJET1.2载体上得到重组质粒并导入E.coli菌株TOP10，筛选出阳性克隆，提取质粒；

（3）将步骤（2）获得的质粒双酶切，将凝胶回收的SEQ ID No.1表示的核苷酸序列与经双酶切的植物表达载体pBI121进行连接，转化E.coli菌株TOP10；

（4）用SEQ ID No.2、SEQ ID No.3筛选含有抗性质粒的菌落，提取质粒并进行质粒PCR验证、BamHI/SacI双酶切验证，挑选正确的重组子，将其命名为pBI121WIN4；

（5）将pBI121-WIN4通过电击法转入根癌农杆菌C58中，得到的菌落进行菌落PCR鉴定，大小为981bp片段的菌落即为正确的菌株；

（6）将步骤（5）获得的菌株转化欧美杂交杨（Populus deltoides×Populus nigra），获得一种抗杨尺蠖害虫的转基因欧美杂交杨。

本发明将杂交杨（Populus trichocarpa×Populus del toides）中编码创伤应答蛋白WIN4的基因导入欧美杂交杨（Populus deltoides×Populus nigra）中得到一种抗杨尺蠖害虫的转基因欧美杂交杨（转基因杂交杨），利用转基因杂交杨和非转基因欧美杂交杨（Populus deltoides×Populus nigra）(对照植物)的叶片分别饲喂杨尺蠖，结果证明，本发明的转基因杂交杨对杨尺蠖幼虫的致死率显著优于对照植物；转基因杂交杨对杨尺蠖幼虫生长发育的负面影响显著高于对照植物；转基因杂交杨对杨尺蠖成虫的化蛹率、羽化率、产卵量和卵孵化率的负面影响均显著高于对照植物。

本发明通过将创伤应答蛋白WIN4基因遗传转化重要林木植物欧美杂交杨以提高其抗虫能力，利用该方法能够显著提高欧美杂交杨对我国杨树主要食叶害虫之一——鳞翅目杨尺蠖的抗虫能力，为培育抗虫林木提供了一种十分有效的方法，对降低农药使用、延缓害虫抗性的产生具有一定的意义，对维持生态系统的平衡和可持续发展也有重大的应用价值。

附图说明

图1为来源于杂交杨（Populus trichocarpa×Populus deltoides）的创伤应答蛋白基因cDNA的克隆。

图2为携带创伤应答蛋白基因WIN4的植物表达载体图。

图3为转基因杂交杨基因组DNA的PCR检测。

图4为转基因杂交杨的RT-PCR检测。

具体实施方式

下述结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

本发明所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：转基因杂交杨的获得