[发明专利]一种快速降解甲基睾丸酮的基因工程菌及其用途

权利要求书

1.一种快速降解甲基睾丸酮的基因工程菌，命名为：睾丸酮丛毛单胞菌Comamonas Testosteroni PK-4，该基因工程菌株已于2013年1月15日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCC No.7135。

2.获得权利要求1所述快速降解甲基睾丸酮的基因工程菌的筛选方法，包括以下步骤完成：

（1）根据基因序列（GenBank accession No. AHIL00000000），以3,17β-羟基类固醇脱氢酶基因为中心绘制基因图谱，选取离3,17β-羟基类固醇脱氢酶基因较近的其它基因，分析其表达产生的蛋白质的性质，最终选取PhaR基因为目的基因；

（2）利用PCR技术从睾丸酮丛毛单胞菌基因组中获得PhaR基因前300bp的突变基因片段，然后将该突变基因片段克隆至表达载体pCR2.1-TOPO上，获得含有突变基因片段的表达载体pPK-8，再利用电穿孔导入法将pPK-8质粒整合到睾丸酮丛毛单胞菌的染色体基因组中，通过同源重组而使得染色体上的PhaR基因失活；

利用含有卡那霉素和氨苄青霉素的LB固体培养基筛选出阳性克隆，再通过PCR技术进行验证，最终获得PhaR基因敲除的目标菌株PK-4。

3. 根据权利要求2所述快速降解甲基睾丸酮的基因工程菌的筛选方法，其特征在于获得PhaR基因前300bp的突变基因片段和验证PhaR基因是否敲除的PCR技术的引物序列分别为：

正向引物5'-ATGACAAGAAAACAAAGAG-3'，

反向引物为5'-CTGCATGGCATGACCATA-3'；

正向引物5'-CATAAAGGACTTGCG-3'，

反向引物为5'-  ACGGCCGCCAGTGTG-3'。

4. 根据权利要求1所述的睾丸酮丛毛单胞菌基因工程菌降解去除养殖废水中甲基睾丸酮的应用。