[发明专利]CEACAMl蛋白磁粒的制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种人癌胚抗原相关细胞黏附分子1(CEACAMl)细胞外特定结构域融合蛋白的表达、纯化的方法和应用，属于分子生物学和应用微生物学领域。

背景技术

癌胚抗原相关细胞粘附分子1(CEACAM1，NCBI GenBank:NM_001712)是广泛表达于中性粒细胞、巨噬细胞、上皮细胞及淋巴细胞表面的跨膜糖蛋白,属癌胚抗原家族免疫球蛋白超家族粘附分子，其生物学功能包括促进血管的形成,调节血管的重塑，参与细胞凋亡的调控、促进腺体管腔的形成及调控胰岛素的清除以维持细胞对胰岛素的敏感性，同时CEACAM1也是致病微生物的粘着受体。淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae，NG)和脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitides，NM)通过其细胞膜表面的Opa(colony opacity-associated)蛋白与粘膜上皮和内皮细胞的CEACAM1受体结合，使其粘附并侵入细胞，以利于吞噬细胞吞噬。Opa蛋白是存在于NG和NM细胞壁上的膜蛋白，是这两种致病微生物的主要侵袭蛋白。

微纳米磁粒是通过化学反应产生的以Fe3O4为核心的超磁性颗粒，其大小为200nm~1μm，具有无磁记忆性，表面积大的特点，可在其表面包裹自由羧基、羟基等基团，再通过偶联剂与蛋白质等生物大分子结合，目前被用于核酸、蛋白质、细胞的分离纯化，肿瘤的定向靶诊断与治疗。

目前的研究已经克隆表达了CEACAM1细胞外的部分结构域，并获得纯度较高的蛋白，但还没有相应制备CEACAMl蛋白磁粒复合物，用于淋病奈瑟氏菌的快速分离，以提高临床诊断的敏感性和特异性的相关技术报道，也没有CEACAM1与水体蓝藻相互作用的报道。

微纳米磁粒是后基因组时代生物大分子和细胞分离纯化的有力武器，具有快速、特异性高、无毒、无污染、有利于机械自动化大样本处理的新技术材料，可在其表面包被带正电荷的硅、金属镍、及不同的蛋白质如蛋白A等，可应用于DNA、RNA、mRNA、抗体、蛋白质、细胞、病毒和细菌的分离纯化1-3。但该技术仅国外少数几个公司(如挪威的Dynabeads)拥有且保密，售价很高，普及受限。

CEACAM1属I型膜蛋白，广泛存在于白细胞、内皮细胞和上皮细胞的细胞膜上^4-6，该蛋白具有许多重要的生物学功能，如能抑制肿瘤及上皮细胞的生长和增殖^7，8，抑制T细胞和NK细胞的细胞毒性效应^9，10，延迟粒细胞和单核细胞的凋亡¹¹，通过调控胰岛素的清除而维持细胞对胰岛素的敏感性^12，13。该蛋白分子量51KDa，由细胞外、跨膜区、胞质内三个结构域组成，胞外结构域与细胞间的同质粘附(homotypic adhesion)和异质粘附(heterotypic adhesion)有关^14-16，该结构域通过剪切可激活caspase-1和-3参与细胞凋亡的调控¹⁷。胞内结构域由C端的12~14个氨基酸组成，与细胞生长和信号传导有关¹⁸。CEACAM1在表达时有不同的剪切体，它们的差异主要在胞内结构域，据此分为长短两型，而胞外结构域是较保守的^19，20。

奈瑟氏菌常寄生于动物粘膜表层，Opa是这该类革蓝氏染色阴性细菌细胞壁上的粘附蛋白，在细菌粘着及侵入粘膜上皮和内皮细胞中起重要作用，同时它也是中性粒细胞、巨噬细胞及CD4+T淋巴细胞的免疫调节剂^9，14，是该类细菌的主要抗原。Opa蛋白虽然像其它细菌抗原一样，为逃避宿主免疫，其基因和氨基酸序列会发生突变，但在体外的研究中发现，在绝大部分突变体中，Opa蛋白仍能与CEACAM1结合^21-24，其突变区域与其它受体的结合有关，这说明Opa蛋白具有与宿主细胞膜多种受体结合的潜力，但无论怎样突变，它仍然保持其与CEACAM1结合的最基本的功能。