[发明专利]一种根癌农杆菌介导川蔗23号遗传转化Bt基因的方法

权利要求书

1.一种根癌农杆菌介导川蔗23号遗传转化Bt基因的方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）胚性愈伤组织的获取：以川蔗23号的幼嫩叶鞘为外植体，经灭菌后切成幼叶卷，接种于胚性愈伤诱导培养基上，25℃黑暗培养，诱导胚性愈伤组织；

（2）胚性愈伤组织的预培养及预处理胚性：将胚性愈伤组织转入胚性愈伤诱导培养基中，于25 ℃黑暗培养3～4 d；然后将胚性愈伤组织于浸染前在超净工作台风干处理30～45 min，至其微微干缩；

（3）携带有植物表达载体及目的基因的农杆菌工程菌液的制备：挑取携带pCAMBIA1301质粒与目的基因Bt的农杆菌菌株EHA105单菌落于农杆菌培养基上划线培养，48～72 h后刮取长0.5～1.0 cm的菌体，悬浮于农杆菌活化培养基内，其OD₆₀₀为0.1，再置于28 ℃，180 rpm条件下振荡培养2 h，以诱导农杆菌vir基因的活化表达，此菌液即为转化工程菌液；

（4）工程菌液浸染胚性愈伤组织：将预处理的胚性愈伤组织浸没于工程菌液中感染1.5～2 min，转到滤纸上吸干多余菌液；

（5）胚性愈伤与农杆菌共培养：将浸染的胚性愈伤组织转入共培养培养基中，于23 ℃黑暗培养3～4 d；

（6）抗性愈伤、抗性芽及抗性小苗筛选培养：将共培养后的胚性愈伤组织用无菌水清洗至无浑浊后，用含有羧苄青霉素(Car) 500 mg·L^-1的无菌水浸泡2 min，再用无菌水清洗3次，无菌滤纸吸干后，接种于抗性胚性愈伤筛选培养基上，25 ℃黑暗培养15～20d，转入抗性芽筛选培养基上，25 ℃，2000 lx光照强度下培养以诱导芽的形成，当抗性芽长至5 cm左右时，转入生根筛选培养基上以筛选抗性完整植株；

（7）抗性植株PCR检测。

2.如权利要求1所述的一种根癌农杆菌介导川蔗23号遗传转化Bt基因的方法，其特征在于：所述胚性愈伤诱导培养基以MS为基本培养基并添加1～2 mg·L^-1的2,4-D与0～50 mg·L^-1 的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）。

3. 如权利要求1或2所述的一种根癌农杆菌介导川蔗23号遗传转化Bt基因的方法，其特征在于：步骤（1）诱导培养时间为40～50 d，选取淡黄色、结构疏松、颗粒状、胚性一致的愈伤组织进行步骤（2）的操作。

4. 如权利要求1或2所述的一种根癌农杆菌介导川蔗23号遗传转化Bt基因的方法，其特征在于：所述农杆菌培养基以YEP为基本培养基并添加50mg·L^-1的卡那霉素（Kan）、50mg·L^-1的利福平（Rif）和15 g·L^-1的琼脂（Agar），所述农杆菌活化培养基以AAM为基本培养基并添加100～150μm·L^-1的AS。

5.如权利要求1或2所述的一种根癌农杆菌介导川蔗23号遗传转化Bt基因的方法，其特征在于：所述培养基以胚性愈伤诱导培养基并添加100～150μm·L^-1的AS。

6.如权利要求1或2所述的一种根癌农杆菌介导川蔗23号遗传转化Bt基因的方法，其特征在于：所述抗性胚性愈伤筛选培养基为胚性愈伤诱导培养基并添加潮霉素（Hyg）20～30 mg·L^-1+Car 300～500 mg·L^-1。

7.如权利要求1或2所述的一种根癌农杆菌介导川蔗23号遗传转化Bt基因的方法，其特征在于：所述抗性芽筛选培养基以MS为基本培养基并添加6-BA 1.0～2.0 mg·L^-1+NAA 0.1～0.5 mg·L^-1+Hyg 20～30 mg·L^-1+Car 300～500 mg·L^-1+PVP 0～50 mg·L^-1。

8.如权利要求1或2所述的一种根癌农杆菌介导川蔗23号遗传转化Bt基因的方法，其特征在于：所述生根筛选培养基为1/2 MS+ NAA 1.0～2.0 mg·L^-1+Hyg 20～30 mg·L^-1+Car 300～500 mg·L^-1。

9.如权利要求1或2所述的一种根癌农杆菌介导川蔗23号遗传转化Bt基因的方法，其特征在于：所述的PCR分子检测是根据Bt（Cry1Ab）序列合成反应引物，分别以潮霉素抗性植株的DNA、对照甘蔗植株的DNA及质粒DNA为模板，进行PCR扩增检测。