[发明专利]纯白色真姬菇Finc-W-90的分子标记及其获得方法与应用

说明书

【技术领域】

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种纯白色真姬菇Finc-W-90的分子标记及其获得方法与应用。 

【背景技术】

真姬菇（拉丁文名称Hypsizygus marmoreus），隶属担子菌亚门、层菌纲、伞菌目、白蘑科、离褶菌族、玉蕈属，因它具有独特的蟹鲜味，故又称它为蟹味菇。最初的人工栽培于1978年前后开始于日本，其味道鲜美、食感脆嫩、营养丰富，其味比平菇鲜，其肉比滑菇厚，其质比香菇韧，口感甚佳，其干品还香味浓溢。真姬菇含有丰富的维生素和17种氨基酸，子实体中提取的β-葡聚糖具有很高的抗肿瘤活性，是一种低热量、低脂肪的保健食品。 

传统食用菌菌种鉴别，尤其对于真姬菇，其主要依据是子实体的外观形态、拮抗试验、出菇对比等。外观形态易受栽培环境（温度、湿度、CO₂浓度、光照强度及通风等）和配方的影响，造成外观形态鉴定的困难。亲缘关系较近的菌株之间（比如有些亲本和子代之间），拮抗现象不明显，通过拮抗试验鉴别菌种也存在困难。出菇对比试验耗时至少4个月，不利于菌种的鉴定和检测。随着分子生物学的发展，分子标记法越来越广泛地用于菌种的鉴别。SCAR（Sequence-characterized Amplified Region）标记是一种十分稳定的分子标记，能够简便、快速、稳定的进行菌种鉴定，但目前尚未有对纯白色真姬菇Finc-W-90的SCAR分子标记，以便快速鉴定纯白色真姬菇Finc-W-90。 

【发明内容】

本发明解决的技术问题是解决现有技术存在的缺陷，提供一种纯白色真姬菇Finc-W-90的分子标记及其获得方法与应用。 

本发明采用PCR技术进行了大量的筛选试验，其中，采用随机引物（序列为：TGCTCTGCCC）获得了真姬菇菌株Finc-W-90的特异DNA片段，分子量为769bp，将该片段克隆测序，以此片段的DNA序列为基础，设计特异PCR扩增引物，其特异引物对序列为：5'CTCTGCCCTACATCTAATCTGC3'和5'CCCAAGCTACATTGACAATGATAG3'。该引物对对真姬菇Finc-W-90菌株进行PCR扩增，可以获得分子量大小为758bp的特异片段，即为真姬菇菌株Finc-W-90的分子标记。 

本发明还公开一种纯白色真姬菇Finc-W-90菌种的分子标记的获得方法，其特征在于包括如下步骤： 

1）获得菌丝或者子实体； 

2）基因组DNA提取； 

3）RAPD法分析并获得特异DNA片段：采用RAPD法分析并获得真姬菇菌株Finc-W-90的特异DNA片段所用随机引物序列为：TGCTCTGCCC。 

4）特异引物设计：以上述获得的特异DNA片段序列为基础，设计特异PCR扩增引物，引物对序列 是5'-CTCTGCCCTACATCTAATCTGC-3'和5'-CCCAAGCTACATTGACAATGATAG-3'； 

5）SCAR分子标记的PCR扩增：用特异PCR扩增引物对真姬菇Finc-W-90菌株的基因组进行SCAR-PCR扩增，得到758bp的特异分子标记。 

6）电泳检测。 

所述步骤3）中RAPD法的PCR扩增反应体系为：总体积25μL：基因组模板20-30ng/μL 1.0μL，随机引物0.5pmol/μL 1.0μL，10mM dNTP mix0.5μL，10×Taq缓冲液2.5μL，25mM MgCl₂ 2.0μL，Taq酶5U/μL 0.25μL，加水至25μL；PCR反应条件：预变性95℃3min；94℃45s，36℃60s，72℃2min，35个循环；72℃延伸10min；纯白色真姬菇Finc-W-90菌株特异DNA片段大小为758bp。 

所述步骤5）中SCAR分子标记的PCR扩增，其体系为：总体积25μL，模板20～30ng/μL 1μL，真姬菇Finc-W-90特异引物对0.5pmol/μL各0.5μL，10mM dNTP mix0.5μL，10×Taq Buffer 2.5μL，25mM MgCl₂ 2.0μL，Taq酶5U/μL 0.25μL，加水至25μL；PCR反应条件：预变性95℃3min；94℃30s，62℃30s，72℃1min，35个循环；72℃延伸5min。